Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 1

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1 Les propriétés cinétiques de l'aspartate transcarbamylase - jour 1

2 8 octobre 12 novembre Travail de session
consultez la liste des enzymes assignées sur le site web Dates limites: Approbation: Remise: 8 octobre 12 novembre

3 ATCase - but étudier les propriétés cinétiques d'une enzyme allostérique, aspartate transcarbamylase (ATCase) d'E. coli

4 ATCase - objectifs préparer ATCase d'E. coli analyser et interpréter la cinétique d'ATCase (une enzyme allostérique) -graphiques: 1. Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Eadie-Hofstee Hill -valeurs cinétiques: Vmax, Km, nH

5 ATCase - objectifs apprendre à utiliser un logiciel de régression non-linéaire ( "curve fitting" ) avec une enzyme allostérique pour déterminer Vmax, Km et nH apprendre à manipuler avec précision et avec prudence

6 Annexe I - rappel de cinétique
graphique Michaelis-Menten ( V vs [S] ) graphique Lineweaver-Burk ( 1/V vs 1/[S] ) graphique Eadie-Hofstee ( V vs V/[S] ) Km Vmax Vmax/2

7 Cinétique - nouveau termes/concepts
graphique Hill ( log (V/Vmax-V) vs log [S] ) coefficient de Hill (nH) M-M pour les enzymes allostériques

8 Graphique de Hill log (V/Vmax-V) vs log [S] pente = coefficient de Hill (nH)

9 M-M pour les enzymes allostériques
enzyme michalienne

10 M-M pour les enzymes allostériques
enzyme allostérique Kprime ≠ [S] à Vmax/2 Khalf = [S] à Vmax/2 (Kprime = Khalf) nh

11 Enzymes allostériques
l'activité peut être modifiée par l'attachement d'un effecteur l'effecteur se lie à un site autre que le site actif induit un changement de configuration de l'enzyme souvent l'enzyme qui catalyse la 1ère réaction d'une voie biosynthétique non branchée

12 Enzymes allostériques
Enz Enz Enz Enz4 A B C D E Enzyme 1 est une enzyme allostérique. Inhibition

13 Biosynthèse des pyrimidines
ATP est un activateur d'ATCase assure une production égale de purine et de pyrimidines CTP ATCase Inhibition

14 ATCase catalyse la réaction commettre de la voie biosynthétique des pyrimidines Doser par une réaction colorimétrique

15 réaction colorimétrique
ATCase - en labo réaction enzymatique -produit carbamyl aspartate -30 min à 30oC réaction colorimétrique -met en évidence la carbamyl aspartate produite -2 hrs à 60oC -donne un produit coloré qui est dosé à l’aide du spectrophotomètre + courbe standard

16 Réaction colorimétrique
2 hrs à 60oC 1 vol : vol

17 Graphique Michaelis-Menten

18 Michaelis-Menten d'ATCase

19 Michaelis-Menten d'ATCase

20 Michaelis-Menten d'ATCase

21 Michaelis-Menten d'ATCase

22 Michaelis-Menten d'ATCase

23 BCM311 - résultats typiques
À noter: ►Kprime n'est pas la [S] à Vmax/2 ►ici à titre d'exemple seulement Vmax ne change pas Kprime change

24 Organigramme - semaine 1
Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes)

25 Organigramme - semaine 1
Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes) Courbe standard de carbamyl aspartate (1/équipe) Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes)

26 Organigramme - semaine 1
Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes) Courbe standard de carbamyl aspartate (1/équipe) Détermination de la dilution enzymatique idéale (3X Série A par équipe) Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes) Courbe standard de carbamyl aspartate (1/équipe) Préparation d'ATCase de E.coli (1/2 équipes) Semaine prochaine: activité d’ATCase en présence des effecteurs

27 Préparation d'ATCase

28 Préparation d'ATCase 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5)

29 Préparation d'ATCase 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5)
Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5)

30 (1,6 ml tampon de lyse froid)
Préparation d'ATCase 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14)

31 (1,6 ml tampon de lyse froid) (1,6 ml tampon de lyse froid)
Préparation d'ATCase 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5)

32 Préparation d'ATCase 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5)
Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) (15K, 4oC, 20 min, JA-17) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid)

33 Préparation d'ATCase Garder surnageant 200 ml de culture/2 équipes
(DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) (15K, 4oC, 20 min, JA-17) Garder surnageant (extrait brut ATCase) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) Ultrasons (8 X 30 secs, intensité max.) (15K, 4oC, 20 min, JA-17) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14) Resuspendre (1,6 ml tampon de lyse froid) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) 200 ml de culture/2 équipes (DO566 = 1,3-1,5) Centrifuger (5K, 4oC, 20 min, JA-14)

34 gardez une aliquote pour travailler
Préparation d'ATCase gardez une aliquote pour travailler le plus vite possible, congelez la préparation en l'immergeant dans de l'azote liquide conservez-la à -80oC jusqu'à la semaine prochaine Garder surnageant (extrait brut ATCase)

35 Dilution à utiliser produit 0,05 - 0,10 μmoles de carbamyl aspartate (30 min, 1 ml) de plus, on veut être capable de voir la section sigmoïde de la courbe

36 Dilution à utiliser Pourquoi est-ce qu'on peut utiliser DO pour vitesse pour voir l'allure de la courbe ?

37 DO pour vitesse la courbe standard est linéaire relation linéaire entre V et DO466 allure de MM ne change pas, seulement les valeurs de V

38 Dilution à utiliser DO466 = 50 μM CA de la courbe standard
équivaut à la production de 0,1μmoles de CA

39 2 équipes/préparation d’ATCase: équipe 1: 1/100; 1/500; 1/1000
Dilution à utiliser 2 équipes/préparation d’ATCase: équipe 1: 1/100; 1/500; 1/1000 équipe 2: 1/2000; 1/5000; 1/10000

40 Préparation des dilutions - précision
Ex. : 3 ml d'une dilution 1/2000

41 2 équipes/préparation d’ATCase: équipe 1: 1/100; 1/500; 1/1000
Dilution à utiliser 2 équipes/préparation d’ATCase: équipe 1: 1/100; 1/500; 1/1000 équipe 2: 1/2000; 1/5000; 1/10000 diluez dans du 80 mM phosphate faire approuver le choix de dilution avant de quitter (graphiques MM avec GraphPad) vérification de la courbe standard (GraphPad) remettre le fichier GraphPad

42 Dilution à utiliser

43 Dilution à utiliser Dilution à utiliser: 1:2000

44 Points techniques congélation de l'enzyme: N2(l) + -80oC gardez seulement une aliquote non-congelé garder l'enzyme sur glace en tout temps sauf durant l'incubation 1 préparation d'enzyme / 2 équipes (arrangez-vous!) une courbe standard par équipe

45 Points techniques N'oubliez pas de balancer les tubes AVANT de les centrifuger! mettre un tube équilibre en face de votre tube

46 Points techniques N'oubliez pas de balancer les tubes AVANT de les centrifuger!

47 Points techniques N'oubliez pas de balancer les tubes AVANT de les centrifuger! Sinon... La soucoupe volante vue hier était en fait un rotor débalancé.

48 Lunettes et gants obligatoire
Points techniques Lunettes et gants obligatoire N'oubliez pas de balancer les tubes AVANT de les centrifuger! préparer le réactif (attention: H2SO4) colorimétrique juste avant son utilisation (protège-le de la lumière) préparer seulement le volume du réactif requis (~135 ml; tubes = 114 ml) lire les DO rapidement après la terminaison des réactions: la couleur diminue avec le temps

49 Points techniques Réactions à 30oC (bains personnels) réactifs (tubes) préchauffés laissez des intervalles assez longs vérifiez la température des bains

50 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions acide perchlorique 2% (préparer 500 ml / table) (garder pour J2) aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table) tampon de lyse (Tris-Cl 0,1 M pH 9,2) (une table prépare 100 ml, 20 ml / table, stériliser, refroidir) - équipe volontaire de table C

51 Point technique - préparation d'une solution
Mettre 3/4 du volume H2O. Barreau magnétique + agiter. Dissoudre les poudres etc. Ajuster le pH. Compléter au volume.

52 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions acide perchlorique 2% (préparer 500 ml / table) (garder pour J2) aspartate 125 mM (préparer 50 ml / table) carbamyl phosphate 36 mM (préparer 50 ml / table) tampon de lyse (Tris-Cl 0,1 M pH 9,2) (une table prépare 100 ml, 20 ml / table, stériliser, refroidir) - équipe volontaire de table C

53 préparation des solutions
Points techniques préparation des solutions tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0 (mélange de 2 solutions, Na2HPO4 160 mM et NaH2PO4 160 mM) Na2HPO4 160 mM (Na2HPO47H2O) (une table prépare 3 L) - table B NaH2PO4 160 mM (NaH2PO4H2O) (une table prépare 2 L) - table D tampon sodium phosphate 0,16 M pH 7,0 (une table prépare 4,35 L du tampon final, ml / table) (garder pour J2) - tables B + D

54 Utilisation des micropipettes
Aspiration l'embout devrait être immergée 3 mm dans le liquide avant d'aspirer vitesse d'aspiration: lente et constante attendre 1 seconde avant de retirer la pipette la dernière goutte attachée à l'extérieur de l'embout devrait être éliminée en glissant la pointe de l'embout sur la paroi du tube

55 Utilisation des micropipettes
Livraison sur la paroi du tube ou directement dans le liquide à une vitesse lente et constante

56 ATCase - questions ?