Paris Necker-Enfants Malades

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1 Paris Necker-Enfants Malades
Leucémies Aiguës Lymphoblastiques: « La biologie spécialisée dans la stratification thérapeutique  » Vahid Asnafi Paris Necker-Enfants Malades SAHTS, Alger 02/10/2015

2 Prognostic Factors in ALL:
Patient Age ECOG-PS Comorbidities Disease WBC CNS disease Phenotype Genomics Response Steroid sensitivity Early BM clearance Late CR MRD

3 Prognostic Factors in ALL: biologie spécialisée
Patient Age ECOG-PS Comorbidities Disease WBC CNS disease Phenotype Genomics Response Steroid sensitivity Early BM clearance Late CR MRD

4 Disease Response Patient Age ECOG-PS Comorbidities WBC CNS disease
Phenotype Genomics Response Steroid sensitivity Early BM clearance Late CR MRD

5 Prognostic Factors in ALL
Patient Age ECOG-PS Comorbidities Disease WBC CNS disease Phenotype Genomics Response Steroid sensitivity Early BM clearance Late CR MRD L’impact pronostic du phénotype est effacé par les régimes thérapeutiques actuels Le phénotype est tj nécessaire pour le diagnostic mais, à défaut de nouveaux marqueurs, peu utile à la stratification thérapeutique

6 Disease Response Patient Age ECOG-PS Comorbidities WBC CNS disease
Phenotype Genomics Response Steroid sensitivity Early BM clearance Late CR MRD

7 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes sur 20 ans!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique… 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique!!

8 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique…. 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique!!

9 La biologie de la leucémie avant l’ère du séquençage
Cytologie conventionnelle Chromosome Cellule Caryotype conventionnel Peinture chromosomique FISH Protéine FISH PCR Cytométrie en Flux Immunocytochimie DNA En bleu TK haut-débit PCR/RT-PCR 9

10 Types d’anomalies observées
Gène A Gène B Lésion génomique Conséquence fonctionnelle

11 Somatic genetic abnormalities in ALL in 2005
Children 85% BCP-ALL 25% t(12;21):TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) 3% BCR-ABL 5% t(1;19): E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) <3% MLL (INTERFANT) ≈ 60% ? 15% T-ALL 10-15 % SIL-TAL1 5 % Hox11 25% Hox11L2 5-10 % CALM-AF10 5-10 % MLL ≈ 40% ?

12 Somatic genetic abnormalities in ALL in 2005
Children Adults 85% BCP-ALL 25% t(12;21):TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) 3% BCR-ABL 5% t(1;19): E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) <3% MLL (INTERFANT) ≈ 60% ? 75% BCP-ALL 25% BCR-ABL < 3%TEL-AML1 5% E2A-PBX1 5% MLL-AF4 ≈ 60% ? 15% T-ALL 10-15 % SIL-TAL1 5 % Hox11 25% Hox11L2 5-10 % CALM-AF10 5-10 % MLL ≈ 40% ? 25% T-ALL 10 % SIL-TAL1 15 % Hox11 10 % Hox11L2 10 % CALM-AF10 5-10% MLL 50% ?

13 Pui et al, N Engl J Med 2004

14 Somatic genetic abnormalities in ALL in 2005 (stratifying<10% of cases)
Children Adults 85% BCP-ALL 25% t(12;21):TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) 3% BCR-ABL 5% t(1;19): E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) <3% MLL (INTERFANT) ≈ 60% ? 75% BCP-ALL 25% BCR-ABL < 3%TEL-AML1 5% E2A-PBX1 5% MLL-AF4 ≈ 60% ? 15% T-ALL 10-15 % SIL-TAL1 5 % Hox11 25% Hox11L2 5-10 % CALM-AF10 5-10 % MLL ≈ 40% ? 25% T-ALL 10 % SIL-TAL1 15 % Hox11 10 % Hox11L2 10 % CALM-AF10 5-10% MLL 50% ?

15 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique…. 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique!!

16 Les marqueurs moléculaires et/ou cellulaires permettent le suivi de la maladie résiduelle
BDR = Blast cell decrease Rate (Fonte des blastes) dans LAM Biologie de la tumeur : théranosie 2 approches qui dans le concept s’opposent mais dans la pratique se complètent On traite on observe on adapte le traitement on observe on adapte le traitement 16

17 Les marqueurs moléculaires et/ou cellulaires permettent le suivi de la maladie résiduelle
BDR = Blast cell decrease Rate (Fonte des blastes) dans LAM Biologie de la tumeur : théranosie 2 approches qui dans le concept s’opposent mais dans la pratique se complètent On traite on observe on adapte le traitement on observe on adapte le traitement 17

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20 STRATIFICATION Traitement des LAL – Adapté au risque Préphase de CTC
Corticosensibilité Préphase Induction L-Asparaginase Augmentation des doses de MTX, VCR Chimiosensibilité RC + MRD Consolidation MRD Maintien de la dose-intensité Fortes doses de MTX STRATIFICATION Intensification retardée n°1 MRD Conditionnement atténué Consolidation/Interphase Avec comme objectifs: Une certaine décroissance thérapeutique chez l’enfant Une intensification chez l’adulte Intensification retardée n°2 Intensification Entretien (2 ans) MRD Thérapies ciblées Prophylaxie neuroméningée

21 Relapse-free survival of the three MRD-based risk groups of children treated for ALL according to protocols of the International BFM Study Group. The three risk groups were defined by combined MRD information at the end of induction treatment and before consolidation treatment ASH Education Book January 1, 2002 vol. 2002

22 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique…. 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique!!

23 La biologie de la leucémie avant l’ère du séquençage
Cytologie conventionnelle Chromosome Cellule Caryotype conventionnel Peinture chromosomique FISH CGH Array / SNP Array FISH PCR DNA En bleu TK haut-débit Séquençage Séquençage haut débit RNA / miRNA RQ-PCR DNA-Chip mi-RNA Chip 23

24 Deletions > amplifications
Nature; 2007 BCR-ABL, TCF3-PBX1, ETV6-RUNX1, réarrangements de MLL, hyper ou hypodiploïdies sont des lésions génétiques importantes pour l’initiation de la leucémie mais sont insuffisantes pour générer seules un phénotype leucémique, indiquant que des anomalies coopératives sont nécessaires. Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia (SNP array) Deletions > amplifications 40% B-ALL: altérations de gènes impliqués dans différenciation B: EBF1, PAX5, IKAROS

25 Apports des analyses pangénomiques – Un modèle de leucémogénèse
un modèle physiopathologique de leucémogénèse, dans lequel un progéniteur lymphoïde acquiert très précocement un réarrangement chromosomique qui entraine dérégulation transcriptionnelle et épigénétique. Cette translocation associée ou non à la survenue d’évènements génétiques secondaires permet l’arrêt de la maturation lymphoïde. L’accumulation d’anomalies génétiques ciblant des voies de signalisation cellulaire perturbent la régulation du cycle cellulaire, la suppression tumorale, et entrainent des modifications de la chromatine. Ces différents évènements vont aboutir à la survenue et la prolifération d’un clone tumoral. Mullighan. Hematology 2012

26 Apports des analyses pangénomiques – Nouveaux sous-types de LAL
T-ALL en jaune BCP-ALL en bleu Plus sombre: mauvais pronostic LAL BCR-ABL1 like: anomalies de IKZF1 + surexp de CRLF2 (à part ici) + Activation voie JAK/STAT dans dans plus de la moitié des phi like Et activation d’autres kinases Iamp21: amplification intra-chromosomique du chromosome 21 (amplification d’au moins trois copies de la région contenant AML1) Pui CH et al. Blood 2012; Okamoto et al. Haematologica 2010

27 T-ALL en jaune BCP-ALL en bleu Plus sombre: mauvais pronostic LAL BCR-ABL1 like: anomalies de IKZF1 + surexp de CRLF2 (à part ici) + Activation voie JAK/STAT dans dans plus de la moitié des phi like Et activation d’autres kinases Iamp21: amplification intra-chromosomique du chromosome 21 (amplification d’au moins trois copies de la région contenant AML1) Pui CH et al. Blood 2012; Okamoto et al. Haematologica 2010

28 D IKZF1 : facteur indépendant de mauvais pronostic
IKZF1 dans les LAL-B LES DELETIONS D’IKZF1 SONT ASSOCIEES A UN MAUVAIS PRONOSTIC : - Mullighan et al., NEJ, LAL-B pédiatriques haut risque 75% des enfants délétés IKZF1 rechutent à 5 ans vs 27% de rechutes chez les enfants non délétés - Kuiper et al., Leukemia, LAL-B pédiatriques - Protocole DCOG ALL9 parmi les enfants « risque standard» : 50% de rechutes chez les délétés IKZF1, taux de rechute x12 vs enfants non délétés Yang et al., Cancer Sci, LAL-B pédiatriques 11% dél récurrentes IKZF1, corrélées à EFS et OS réduits indépendamment des facteurs de risque conventionnels D IKZF1 : facteur indépendant de mauvais pronostic 28

29 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique…. 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique L’exemple concret des LAL-T du GRAALL

30 Oncogenèse LAL-T : multi-étape
ACUTE TUMOR Pre-clinical phase Oncogene « passenger » « causative » « negative » Deux grands types d’anomalies: Etroitement corrélées à un stade d’arrêt de maturation: mutuellement exclusives et probablement « fondatrices »

31 Oncogenèse LAL-T : blocage de maturation
b sélection Sélection pos / neg SP CD4+ Pré-TCR TCR cTCRb SP CD8+ CSH CLP Pro-T Pre-T CD4 ISP DP DP (Pre-T2) TCRdim TCRfort TCRd/g TCRb TCRa Immature pre-ab TCR+ Ad : 40% Ped: 15% Ad: 35% Ped: 35% Ad: 25% Ped: 50% Incidence CALM-AF10* MLL* TLX1 TLX3 TAL1 génotype

32 Ces anomalies de type 1 sont individuellement trop rares avec un impact insuffisamment fort pour une stratification dans un cadre protocolaire. Pronostic protocole dépendants A l’échelle individuelle et dans des situations de décision thérapeutique difficile, leur intérêt persiste.

33 Oncogenèse LAL-T : multi-étape
ACUTE TUMOR Pre-clinical phase Oncogene « passenger » « causative » « negative » Deux grands types d’anomalies: Etroitement corrélées à un stade d’arrêt de maturation: mutuellement exclusives et probablement « fondatrices » Non corrélées à un stade précis de maturation: redondantes et correspondant à des lésions « avantage prolifération/survie» (>30!!)

34 Anomalies de type 2 Ferrando et al JCI 2012

35

36 65% des LAL-T FBXW7 : Composant de l’E3 ubiquitine ligase,
liaison au domaine PEST de NOTCH1 pour ubiquitination et dégradation par la voie du protéasome

37 Ben Abdelali et al., Blood, 2011: 232 cas (145 patients GRAALL03/05)

38 69% (143/212) de mutations NOTCH1 et FBXW7
212 patients GRAALL (59 GRAALL03 et 153 GRAALL05) analysés 69% (143/212) de mutations NOTCH1 et FBXW7

39 69% (143/212) de mutations NOTCH1 et FBXW7
212 patients GRAALL (59 GRAALL03 et 153 GRAALL05) analysés 69% (143/212) de mutations NOTCH1 et FBXW7

40 Voie NOTCH Trends in Immunology, sept 2011

41 PTEN PTEN : phosphatase and tensin homolog, gène suppresseur de tumeur, principal inhibiteur de la voie PI3K/Akt (10q23.3, 9 exons, 403 acides aminés, 54 kDa), protéine et lipide phosphatase Fréquemment inactivé dans les cancers (délétion : 70% des glioblastomes, mutation : endomètre, prostate…)

42 RAS G protéine, activité GTPase, impliquée dans la transduction du signal cellulaire oncogènes donnant un avantage de prolifération. Prévalence des mutations de Ras dans les cancers solides : 67%-95% des adénocarcinomes du pancréas: K-Ras ++ (Kipp et al., J Mol Diagn) 40-45% des adénocarcinomes colo-rectaux: K-Ras++ 16-40% des cancers pulmonaires non à petites cellules (Graziano et al., JCO 1999) : K-Ras autres tumeurs solides: mélanomes, cancers de la thyroïde (N-Ras++), cancers de vessie Valeur pronostique controversée Hémopathies: implication de N-Ras le plus souvent syndromes myéloprolifératifs (LMMC, LMMJ) syndromes lymphoprolifératifs (myélome, LNH, Hodgkin) LAM/MDS LAL

43 EFS et OS à 5 ans, en fonction des mutations de K-RAS et N-RAS exon1
Parmi 212 patients N/F dispo : 191 ont eu une recherche de mutation de l’exon 1 de N-Ras et K-Ras (séquençage directe) 21 mutations (10.5%, avec 3 K-Ras et 17 N-Ras, mutation ponctuelle) EFS et OS à 5 ans, en fonction des mutations de K-RAS et N-RAS exon1

44

45 21 patients altérés (12.4%) 6 délétions et 15 mutations de l’exon 7 de type insertion-délétion, EFS et OS à 5 ans, en fonction de PTEN (délétions et mutations de l’exon7)

46 40 patients « altérés » (22.9%) en RAS et PTEN
20 mutations de RAS 21 PTEN altérés (CGH, mutation exon7, dosage allélique) Mutuellement exclusives

47 40 patients « altérés » (22.9%) en RAS et PTEN
20 mutations de RAS 21 PTEN altérés (CGH, mutation exon7, dosage allélique) Mutuellement exclusives

48 Association N/F et RAS/PTEN

49 50%

50 50%

51 New T-ALL risk subsets 40% des « high-risk » ne rechutent pas
Il serait souhaitable d’identifier ces malades pour les remettre dans les standard. Nouveaux marqueurs moléculaires??

52 Plutôt qu’un indigeste catalogue Une pièce en trois actes!
1- les espoirs déçus de l’oncogénétique…. 2- Arrivée en force de la MRD 3- Retour en grâce de l’oncogénétique!! Et l’acte 3 continue ; vous avez dit traiter une LAL?

53 Changes in clonal architecture in ALL.
Dynamic somatic genetics without Simple clonal hierarchy Genetic variegation of clonal architecture and propagating cells in leukaemia Nature: 469, 356–361:2011

54 Intraclonal heterogeneity at diagnosis in T-ALL
Surface CD3 Intracytoplasmic CD3 This is an example of a T-ALL, in which we can clearly identify, within the malignant population, phenotypically different subpopulations. Analyse virutelle n-dimensionnelle

55 Ou des LALs?? Vers un acte 4 ou Le retour du phénotype??
Intraclonal heterogeneity at diagnosis in T-ALL CD45 RA cCD3 CD7 Surface CD3 Intracytoplasmic CD3 This is an example of a T-ALL, in which we can clearly identify, within the malignant population, phenotypically different subpopulations. Analyse virutelle n-dimensionnelle l’acte 3 continue ; vous avez dit traiter une LAL? Ou des LALs?? Vers un acte 4 ou Le retour du phénotype??

56 Grand merci au

57

58 AVANCÉES TECHNOLOGIQUES
Machines plus rapides, robustes, reproductibles Fluidique Accès aux évènements rares Chimie des fluorochromes Élargissement gamme fluorochromes disponibles Technologie des lasers Plus de sources d’excitation Optique Plus de couleurs ! Nouveaux logiciels d’acquisition Faisabilité du plus de couleurs ! Informatique Nouveaux logiciels d’analyse Encore plus de couleurs !

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60

61 CD45 CD45

62 NOUVELLES APPROCHES D’ANALYSES
Fusion logicielle (Virtual Merging)

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