Spécialité : Toxicologie, Environnement et Santé

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1 Spécialité : Toxicologie, Environnement et Santé
MASTER RECHERCHE, SANTE ET APPLICATIONS Mention : Biologie Cellulaire Physiologie et Pathologie Spécialité : Toxicologie, Environnement et Santé Annee universitaire Caractérisation de la toxicité des particules atmosphériques de deux mégacités sur les cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE Mélanie Leroux Responsable Scientifique : Dr. Karine Andréau Bonjour, je suis Mélanie Leroux Je vais vous présentez le travail que j’ai effectué lors de mon stage de 2eme année de Master Toxicologie Environnement Santé J’ai été acceuillie dans le laboratoire des réponses moléculaires et cellulaires aux xénobiotiques RMCX de l’unité de Biologie fonctionnelle et adaptative BFA dirigée par le professeur Jean-Marie Dupret. Encadrée par le docteur Karine Andreau, j’ai étudié la toxicité des particules atmosphériques issues de deux mégapoles sur des cellules épithéliales bronchiques humaines Unité BFA Equipe RMCX « Réponses Moléculaires et Cellulaires aux Xénobiotiques » Directeur: Pr. Jean-Marie Dupret

2 Les particules atmosphériques
Particules terrigènes « Particulate Matter » Composition : Composés organiques Composés biologiques Métaux Cœur carboné PM10: Particules grossières 10 à 2,5µm Particules d’usure PM2.5: Particules fines 2,5 à 0,1µm PM0.1: Particules ultrafines ≤ 0,1µm Les particules atmosphériques, nommées PM pour Particlulate Matter sont divisées en trois grands groupes selon leur diamètre aérodynamique: De 10 à 2,5µm ce sont les particules grossières ou PM10 De 2,5 à 0,1µm ce sont les particules fines ou PM2,5 Et enfin les particules de diamètre inferieur à 0,1µm appelées particules ultrafines ou PM0,1 lorsqu’elles sont atmosphériques Ces particules sont issues de sources variées, elles peuvent être d’origine naturelle comme les particules issues de l’érosion ou anthropiques comme les particules d'usures ou les suies issues du trafic automobile par exemple. Parmis les particules d’origines anthropiques on trouve beaucoup de PM2.5 dont la structure est bien connue et peut se schematiser ainsi: - Un cœur carboné Sur le lequel peuvent s’adsorber différents composés: - Des composés organiques tels que les quinones et hydrocarbures aromatiques polycycliques - Des composés biologiques comme les endotoxines Ou encore des métaux lourds ou de transition Mon projet consistera à étudier la toxicité de ces trois classes de tailles de particules Agrégats microsuies 2

3 Conséquences physiopathologiques
Trachée Bronches Larynx De 3 à 10 µm < 3 µm > 10 µm Bronchioles Effets à court terme: ↗ Morbidité et mortalité Génotoxicité Stress oxydant Réponse inflammatoire Modulation de l’apoptose Alvéoles Effets à long terme: ↗ Maladies respiratoires chroniques: asthme, BPCO… Cancers broncho-pulmonaires Accumulation des PM au niveau des parois bronchiques : remodelage bronchique d’après Churg et al., 2003 Vancouver Mexico Bronchioles pulmonaires (X50) (X200) Les particules atmosphériques vont se déposer dans le tractus respiratoire en fonction de leur taille d’autant plus profondément que leur taille est petite. Les particules fines et ultrafines vont notamment pouvoir atteindre le poumon profond jusqu’au alvéoles pulmonaires. Les effets des particules sur la santé sont bien connus pour les PM10 et PM2,5 A court terme les effets mis en évidence sont : augmentation de la morbidité et la mortalité d’origine cardiovasculaire et respiratoire, au niveau cellulaire on note une réponse inflammatoire , un stress oxydant, des effets génotoxiques, et une modulation de l’apoptose Une exposition chronique à la pollution atmosphérique augmente la prévalence des maladies respiratoires chroniques telles que l’asthme et la broncho-pneumopathie chronique obstructive, ainsi que le risque de cancers bronchopulmonaires. Enfin , comme l’a mis en évidence une célèbre étude de Churg, l’exposition chronique aux PM conduit à l’accumulation des particules au niveau alvéolaire puis épaississement et un remodelage de la paroi bronchique ce qui pourrai notamment expliquer l’exacerbation des maladies respiratoires chroniques que je viens de citer. 3

4 Contexte et Objectifs Projet MEGATOX :
MEGacity Aerosols chemical characterization and TOXicity : Caractérisation chimique et toxicologique des aérosols des mégacités. RMCX: Etudes précédentes PM2.5 parisiennes 2003 non toxiques Effets de protection des PM contre l’apoptose, en lien avec leur composition chimique Objectifs du stage Caractérisation de la toxicité des particules atmosphériques de deux mégacités sur les cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE Étudier la toxicité à court terme sur des cellules épithéliales bronchiques, principalement focalisée sur l’induction d’apoptose, par les trois classes de particules (PM10; PM2.5; PM0.1) issues de deux mégapoles: Paris et Ouagadougou (Burkina-Faso) Mon stage entre dans le cadre du projet MEGATOX acronyme pour MEGacity Aerosols chemical characterization and TOXicity dont le but est la caractérisation chimique et toxicologique des aérosols de deux mégacités prélevés en 2009 De plus des études réalisées précédemment au laboratoire RMCX ont montrées que certaines particules parisiennes prélevées en 2003, suivant leur composition, ne sont pas cytotoxiques mais ont une activité anti-apoptotique sur les cellules épithéliales bronchiques 16HBE Dans ce contexte mon stage à eu 3 objectifs principaux: - Tout d’abord étudier la toxicité, principalement l‘induction d’apoptose par les particules des trois classes de taille issues de Paris et Ougadougou au Burkina-Faso - Comparer les résultats avec ceux obtenus sur les particules fines parisiennes de 2003 - Enfin approfondir les connaissances sur le mécanisme anti-apoptotique des particules et le rôle de leur composition chimique 2) Comparer les résultats avec ceux des études précédentes réalisées sur des PM2.5 parisiennes de 2003. 3) Approfondir les connaissances sur les mécanismes de régulation de l’apoptose par les PM en relation avec leur composition physico-chimique. 4

5 Méthodologie (1) Cellules 16HBE: Particules
Cellules épithéliales bronchiques humaines immortalisées (AgT virus SV40) Particules Prélèvements Ouagadougou (SO2) 2009 Paris (TPE1) Paris (AHO3) 2003 Paris (VEO3) 2003 Lieu Bâtiment de la Météorologie Nationale (4 km du centre ville) Bâtiment du LHVP (3 km du centre ville) Périphérique Porte d’Auteuil Vitry-sur-Seine Date 17 au 18 Novembre 2009 9 au 15 Septembre 2009 20 Janvier au 18 Février2003 18 Juin au 23 Juillet 2003 Heures 17h à 22h (10h total) 6h30 à 10h30 (22h30 total) Continu Sources identifiés Pollution urbaine de fond Poussières des routes (PM10) Trafic : mobylettes (PM2.5) Feux d’ordures (PM2.5) Feux domestiques au bois (PM0.1) Trafic : automobile (PM2.5) Chauffage domestique Trafic : automobiles (PM2.5) Pollution urbaine de fond (PM2.5) Mes études ont été réalisées sur les cellules 16HBE qui sont des cellules épithéliales bronchiques humaines d’un enfant de 1an ayant subit une greffe cœur-poumon, et qui ont été immortalisées par l’antigène grand T du virus SV40. Les particules que j’ai étudié proviennent de deux campagnes de prélèvement réalisées en 2009 et en 2009. Les particules de Ouagadougou 2009 ont été prélevée à proximité du centre de ville, le soir, à des horaires qui correspondent principalement au trafic des mobylettes et aux feux de cuisson du diner et sont nommées SO2. Les particules de Paris 2009 sont nommées TPE1, elles ont elles aussi été prélevées à proximité du centre ville, à des horaires correspondant aux heures de pointes et cible donc le trafic automobile. Les particules parisiennes de 2003 sont des particules fines PM2.5 qui ont été prélevées soit en hiver à proximité du périphérique d’Auteuil ciblant le trafic automobile et nommées AHO3, soit en été à Vitry-sur-Seine nommées VEO3 et correspond à la pollution de fond urbain. Pour mes expériences, jai cultiver les cellules puis je les ai exposé aux particules, soit pendant 24h afin d’étudier l’induction d’apoptose, soit pendant 4H puis 20H additionnelles avec l’inducteur d’apoptose A23 dans le but d’étudier le mécanisme anti-apoptotique. J’ai ensuite étudié la réponse inflammatoire en dosant les cytokines proinflammatoires par ELISA dans le surnageant Puis j’ai etudié l’apoptose par quantification en Cytométrie en flux Exposition des cellules aux particules et inducteurs d’apoptose Culture cellulaire + Traitement Particules (PMO.1, PM2.5, ou PM10) 24H Culture cellulaire + Prétraitement Particules 4H + Inducteur apoptose A23 20H Quantification des cytokines proinflammatoires par ELISA dans le surnageant Quantification de l’apoptose par Cytométrie en flux 5

6 Méthodologie (3) Quantification de la mort par apoptose (cytométrie en flux) Diminution de la taille Bourgeonnement de la membrane plasmique Diffraction de la lumière aux petits angles Modification de la granulosité PMM(↘ ΔΨm) Diffraction de la lumière aux grands angles Fluorescence du DiOC 6(3) vert dans la mitochondrie Exposition des phosphatidylserines Modifications membranaires Stress ox Condensation de la chromatine Fragmentation de l’ADN et du noyau Fluorescence du HE rouge dans le noyau L’apoptose est une forme de mort cellulaire défini par des modifications morphologiques principalement la diminution du volume cellulaire et une modification de la granulosité que j’ai quantifiés par diffraction de la lumière. La modification de la granulosité peut notamment s’expliquée par le bourgeonnement de la membrane plamisque dut à la formation des corps apoptotiques. La membrane subit de nombreuses modofications, telles que l’exposition des phosphatidylserines sur son feuillet externe ainsi que sa perméabilisation partielle de la membrane plasmique que j’ai quantifié par fluorescence grâce au Iodure de Propidium IP Au niveau cellulaire, le premier signal d’apoptose sont les modifications au niveau de la mitochondrie Comme la perméabilisation des membranes mitochondriales ou PMM qui induit la chute du potentiel transmembranaire mitochondrial mitochondrial detla psi que j’ai quantifié grâce au fluorochrome DiOC 6(3) ou DiOC qui s’accumule dans l’espace inter membranire en fonction du delta psi Au niveau cytoplasmique la PMM induit une augmentation du stress oxydant que j’ai quantifié par la fluorescence de l’hydroethydine HE Ces signaux intra-cellulaires vont conduire à l’apoptose nucléaire qui se traduit au niveau du noyau par la condensation de la chromatine et la fragmentation de l’ADN et du noyau Je vous présenterai les résultats de doubles marquages au DiOC et IP ou DiOC et HE Perméabilisation partielle de la membrane plasmique Fluorescence du Iodure de Propidium (IP) rouge dans le noyau Apoptose nucléaire 6

7 Objectif 1 : Projet MEGATOX: Toxicité à court terme
(induction d’apoptose) sur les cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE par les trois classes de particules (PM10; PM2.5; PM0.1) issues de deux mégapoles: Paris et Ouagadougou (Burkina-Faso) Le premier objectif de mon stage était d’étudier la toxicité des particules de Paris et Ouagadougou

8 Résultats (1) 1) a-Etude de la cytotoxicité des particules de Ouagadougou (SO2) PM10 PM10 PM2.5 PM2.5 PM0.1 PM0.1 Sans cellules Les PM10 et PM2.5 de Ouagadougou ne semblent pas cytotoxiques pour toutes les concentration testées Pour étudier la cyototoxicité des particules de Ouagadougou, j’ai d’abord réalisé un test de viabilité WST-1. C’est un test de coloration qui permet de déterminer le pourcentage de cellules vivantes dans des échantillons exposés ou non aux particules des trois classes de tailles. D’après ce test, les particules des trois classes de tailles ne semblent pas cytotoxiques à toutes les doses testées puisque il n’y a pas de baisse de la viabilité. Un résultat étonnant à été obtenu qui à été l’augmentation de la viabilité des cellules avec les particules ultrafines PM0.1 à 10µg/cm², mais ce résultat s’explique par une coloration dut aux particules elles-mêmes puisque elle à aussi été obtenue dans des puis sans cellules. C’est donc un faux positif. Afin de vérifier ces resultats, j’ai quantifier la mort par apoptose par cytométrie en flux en utilisant le double marquage par DiOC/ IP. Les cellules exposées aux deux inducteurs d’apoptose H2O2 et A23 montrent que les cellules sont bien capables de mourir par apoptose. Aucune augmentation de la mort par apoptose n’as été observé chez les cellules exposées aux particules grossières et fines à toutes les doses testées, confirmant que les particules grossières et fines de Ouagadougou ne semblent pas cytotoxiques pour les cellules 16HBE. Les particules ultrafines PM0.1 ne semblent pas cytotoxiques à une faible dose de 0,01µg/cm², mais une faible induction d’apoptose à été observée pour les doses supérieures. Les PM0.1 induisent l’apoptose des cellules 16HBE pour les concentration de 0,1 à 5 µg/cm² PM10 PM2.5 PM0.1

9 Résultats (2) 1) b-Etude de la cytotoxicité des particules de Paris (TPE1) Les PM10et PM2.5 de Paris ne semblent pas cytotoxiques pour toutes les concentrations testées PM10 PM2.5 Les PM10 semblent réduire la sécrétion d’AR et de GM-CSF Concernant les particules de Paris TPE1, la fraction ultrafine récupérée étant très faible, elle n’as pas put être utilisée pour les études toxicologiques. De la même manière j’ai quantifié l’apoptose par cytométrie en flux et on peut voir que les particules grossières et fines ne semblent pas cytotoxiques à toutes les doses testées puisque le pourcentage d’apoptose est identique au témoin. J’ai aussi réalisé cette étude sur des fraction concentrées et aqueuses de particules ultrafines. Ces fractions ont été obtenues par centrifugation d’une solution de particules, le culot formant la fraction concentrée contenant principalement les particules dépourvues de leurs composés hydrosolubles adsorbés et le surnageant la fraction soluble contenant notamment les composés hydrosolubles adsorbés. Même si les particules ne sont pas cytotoxiques, cela ne signifie pas qu’elle n’induisent aucune réponse, j’ai donc étudier la réponse inflammatoire induite par ces particules, Pour cela j’ai quantifié par ELISA la production de trois cytokines proinflammatoires : IL-6, Amphireguline, et GM-CSF Les résultats montrent que les cellules 16HBE secrètent ces cytokines à niveau basal, les particules grossières PM10 semblent réduire la sécrétion d’Amphireguline et GM-CSF, tandis que les particules fines PM2.5 semblent augmenter la sécrétion des trois cytokines. Ces particules semblent donc bien induire une réponse inflammatoire, bien qu’elles ne soient pas toxiques. Les PM2.5 semblent augmenter la sécrétion d’IL-6, d’AR et de GM-CSF pour la concentration de 10 µg/cm². PM10 PM10 PM10 PM2.5 PM2.5 PM2.5

10 Comparer les résultats:  Propriétés anti-apoptotiques ?
Objectif 2 : Comparer les résultats: 2009 vs 2003  Propriétés anti-apoptotiques ? Le deuxieme objectif de mon stage était de comparer mes résultats avec ceux obtenus avec les particules de 2003 Je me suis principalement intéréssée aux propriétés anti-apoptotiques des particules Puisque les études précédentes ont montrées que …

11 Résultats (4) 2) Comparaison des effets des particules de 2009 (TPE1 et SO2) et celles de 2003 (AHO3) AHO3 SO2 TPE1 Puisque les études précédentes ont montrées que les particules AHO3 de 2003 ne sont pas cytotoxiques pour les cellules 16HBE mais on un effet anti-apoptique, c’est-à-dire qu’en présence de ces particules, l’effet de l’inducteur d’apoptose A23 se trouve fortement réduit. Cet effet anti-apoptotique n’as été retrouvé avec les particules de 2009 TPE1 et SO2. Ce résultats nous a donc amener à penser que la composition physico-chimique des particules pourrait jouer un rôle dans le mécanisme anti-apoptotique. PM2.5 PM10 PM2.5 PM10 PM0.1 PM2.5 + A23 15µM Les particules fines de Paris 2003 (AHO3) ne sont pas cytotoxiques mais réduisent l’apoptose induite par le A23187. Les particules de 2009 des différentes classes de taille prélevées à Ouagadougou et Paris semblent sans effet sur l’apoptose induite par A23.

12 Objectif 3 : - Mécanismes de régulation de l’apoptose par les PM
-Liens avec la composition physico-chimique. Lors de mon troisième objectif je me suis donc intéréssée au mécanisme anti-apoptotique en lien avec la composition chimique

13 Quantité métaux (mg/g)
Résultats (5) 3) Rôle des différents métaux dans l’effet anti-apoptotique des particules parisiennes de 2003 (AHO3) Lots de PM2.5 Quantité HAP (µg/g) Quantité métaux (mg/g) Teneur en Fe (qsp 10 µg/cm²) Teneur en Al Teneur en Cu AHO3 210.20 67.36 13,2 mg/g (Fe2+ et Fe3+ = 264 ng) 3,4 mg/g (Al3+= 68ng) 0,86 mg/g (Cu2+ = 17,2 ng) VEO3 34.73 193.26 21,6 mg/g = 432 ng) 20,4 mg/g (Al3+= 408 ng) 0,40 mg/g (Cu2+ = 8 ng) AHO3 VEO3 Les composés organiques (tels que les HAP) ainsi que les composés aqueux (tels que les métaux) participent à l’activité anti-apoptotique des particules AHO3. Afin d’étudier le mécanisme anti-apoptotique des particules, j’ai utiliser comme modèle les particules fines parisiennes prélevées en 2003 dont la composition chimique et les propriétés vis-à-vis de l’apoptose sont connus. J’ai réalisé une première expérience en exposant les cellules soit aux particules AHO3 entières, soit aux particules AHO3 lavées, qui contiennent principalement des composés organiques tels que les HAP, soit à l’extrait aqueux des particules AHO3 contenant principalement les composés hydrosolubles notamment les métaux. Ou au Carbone black qui ne contient que du carbone et qui peut schématiser le cœur carboné de nos particules. Cette première expérience montre que les composés organiques d’une part et les composés hydrosolubles d’autre part sont capables de reproduire partiellement l’effet anti-apoptotique des AHO3 et participeraient donc à ce mécanisme. La comparaison des analyses chimiques des particules AHO3 anti-apoptotique, et VEO3 qui ne sont pas anti-apoptotiques révèle que une forte teneur en HAP et une faible teneur en métaux seraient nécessaires à l’effet anti-apoptotique des particules AHO3. Je me suis intéressée de plus près à la composante métallique en étudiant le rôle de 3 métaux : le Fer, l’Aluminium, et le Cuivre. J’ai exposé les cellules à 10µg/cm² de particules AHO3 ou VEO3 et aux métaux sous forme de sel, aux concentrations contenues soit dans 10µg/cm² de AHO3, soit dans 10µg/cm² de VEO3. Les résultats montrent que ces métaux à la teneur contenue dans les AHO3 sont capables de reproduire partiellement l’effet anti-apoptotique des AHO3 tandis que à la teneur contenue dans les VEO3 ils ne sont pas anti-apoptotique à l’image des VEO3. Ces résultats mon permis de soulever une nouvelle hypothèse : la teneur en certains métaux jouerait un rôle dans l’effet anti-apoptotique des AHO3. La teneur en certains métaux jouerait un rôle dans l’effet anti-apoptotique des AHO3.

14 Conclusions Les particules des trois classes de tailles de Paris et Ouagadougou prélevées en 2009 ne sont pas cytotoxiques pour les cellules 16HBE, comme celles de 2003 Particules Cytotoxicité Effet anti-apoptotique PM2.5 AHO3 Non Oui PM2.5 AEO3 PM2.5 VHO3 PM2.5 VEO3 PM10 TPE1 PM2.5 TPE1 PM10 SO2 PM2.5 SO2 PM0.1 SO2 Oui pour ≥ 0,1µg/cm² à vérifier Mécanisme anti-apoptotique Rôle des HAP et des composés hydrosolubles : Rôle de la teneur en métaux : Fer : 294 ng = Anti-apoptotique 432 ng = Non anti-apoptotique Aluminium : 68 ng = Anti-apoptotique 408 ng = Non anti-apoptotique Cuivre : 17,2 ng = Anti-apoptotique 8 ng = Non anti-apoptotique Contrairement aux particules PM2.5 de Paris prélevées en 2003 (AHO3) les particules prélevées en 2009 ne protègent pas de l’apoptose induite par A23 Les particules fines parisiennes de (TPE1) induisent une réponse inflammatoire caractérisée par l’augmentation de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires IL-6, GM- CSF et AR. Les composés organiques jouer un rôle dans l’effet anti-apoptotique, notamment les HAP via le AhR Pour conclure je vous présente un tableau récapitulatif des résultats obtenus au laboratoire précédemment et lors de mon stage. Les expériences précédentes avaient mis en évidence que les particules prélevées en 2003 n’étaient pas cytotoxiques, mais trois lots sur quatre ont montré une propriété anti-apoptotique. Mon travail à permis de montrer que comme celles de 2003, les particules fines et grossières de 2009 ne sont pas non plus cytotoxiques mais contrairement au trois lots de 2003 aucun effet anti-apoptotique à été révélé. Concernant la cytotoxicité des particules ultrafines de Ouagadougou c’est une donnée à vérifier puisque en réalité les concentrations semblent incertaines. Mon travail à aussi permis de mettre en évidence que les particules fines parisiennes de 2003 induisent une réponse inflammatoire caractérisée par la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Enfin concernant le mécanisme anti-apoptotique des particules. Des études précédentes avaient soulevé le rôle des composés organiques notamment les HAP via le AhR. Et lors de mon stage j’ai put mettre évidence le rôle des composés hydrosolubles, notamment celui de la teneur en certains métaux, comme par exemple le Fer qui est anti-apoptotique à une faible concentration alors qu’il ne l’es plus à une concentration plus forte. Les composés hydrosolubles , notamment la teneur en certains métaux semble jouer un rôle dans le mécanisme anti-apoptotique

15 Perspectives MEGATOX :
Répétition des expériences pour les particules de Paris et Ouagadougou issues d’autres prélèvements Etude de la toxicité des particules ultrafines de Paris et Ouagadougou Etude de la réaction inflammatoire induite par les particules de Ouagadougou Comparaison avec les particules de 2003 et lien avec leur composition chimique Approfondissement de l’étude du mécanisme anti-apoptotique: Par comparaison des compositions chimiques des particules protectrices et non protectrices Utilisation de chélateurs spécifiques des métaux Mes expériences doivent évidement être répétées afin de limiter les biais, notamment avec d’autre particules qui sont en cours de prélèvement. Sur ces nouveaux prélèvement, il faudra porter une plus grande attention à la fraction ultrafine puisque je n’ai put étudier celles de Paris et que les concentration pour Ouagadougou sont incertaines. L’étude de la réaction inflammatoire induite par les particules Ouagadougou est en cours. Enfin, l’analyse physico-chimique des particules de 2009 pourront être comparés avec les particules de 2009 et ainsi faire une lien entre la composition chimique et les propriété des particules vis-à-vis de l’apoptose Afin d’approfondir l’étude du mécanisme anti-apoptotique on pourra notamment comparer les particules anti-apoptotiques et celles sans effets Et enfin, pour comprendre plus avant le rôle des métaux des chélateurs spécifiques des métaux pourront être utilisés.

16 MERCI DE VOTRE ATTENTION

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18 Les cellules sont mises en suspension et soumises à une surpression qui les fait progresser au centre d’une gaine liquide d’entraînement. Les cellules défilent et sont interceptées par le faisceau lumineux émis par le laser. Suite à cette excitation, les cellules émettent des signaux optiques qui sont séparés par des miroirs dichroïques, focalisés par des filtres optiques, puis convertis en signaux électriques par l’intermédiaire des photomultiplicateurs (PMT). Les signaux électriques sont ensuite numérisés puis analysés informatiquement. Des sous-populations cellulaires peuvent être séparées physiquement. Pour cela, la gaine liquide conductrice est fractionnée en gouttelettes qui seront chargées + (tube collecteur 1) ou - (tube collecteur 2), puis déviées de leur trajectoire en passant dans un champ électrique et recueillies dans des tubes différents. 18

19 Contrôles apoptotiques
Témoin - PM10 PM2,5 PM0,1 1 g / cm² 5 g / cm² 10 g / cm² Contrôles apoptotiques Cellules 16HBE + Témoin - H2O2 A23187 + Marqueurs de l’apoptose  Cytométrie en flux Observation des cellules en microscopie à fluorescence Dosage des cytokines pro-inflammatoires et des FC (ELISA):GM-CSF, Amphiréguline Test de viabilité par WST-1 Les expériences ont été réalisées dans deux plaques 24 puits Chaque expérience est réalisée pour les particules d’une même ville et pour les trois classes de particules Les cellules 16HBE (en phase exponentielle de croissance 80% cellule/cm2) sont traitées en triplicatas, en absence, ou en présence des particules à différentes concentrations Des contrôles apoptotiques seront aussi réalisés avec : des inducteurs d’apoptose connus le H2O2 ou peroxyde d’hydrogène, la calcimycine A23187 et un contrôle avec des particules PM2,5 prélevée en 2003 (AEO3 prélevées en été 2003 à proximité du périphérique parisien) Après 24H de traitement, le surnageant est conservé et sera utilisé en tant que milieu conditionné pour l’exposition des cellules endothéliales Les fluorochromes sont ajoutés aux cellules et analysés par cytométrie en flux, comme expliqué précédemment Les cellules seront aussi observées par microscopie à fluorescence En parallèle, dans le cadre du projet MEGATOX avec une étudiante en thèse nous étudierons la réponse inflammatoire Par le dosage de cytokines proinflammatoires dans le surnageant par ELISA et nous analyserons par PCR quantitative la transcription de certains gènes de réponse aux xenobiotiques 19