Dosage et séparation de sucres

Présentation au sujet: "Dosage et séparation de sucres"— Transcription de la présentation:

1 Dosage et séparation de sucres

2 Dosage à la liqueur de Fehling

3 Les oses simples et les diholosides ayant un carbone hémiacétalique libre sont réducteurs de par leur fonction aldéhyde. La fonction aldéhyde est oxydée en fonction acide carboxylique. L'une des fonctions alcool primaire peut être oxydée en fonction acide carboxylique.

4 Réduction de l'ion cuivre II (Cu2+) en oxyde de cuivre I (Cu2O) (liqueur de Fehling).

5 1er temps : réduction de la liqueur de Fehling et oxydation du glucide
            On fait réagir sur une prise d’essai de solution de glucide, un excès de liqueur de Fehling en milieu basique et à l’ébullition.             Cette réaction d’un réducteur est complexe, non stoechiométrique (les proportions de produits réagissant dépendent des conditions opératoires).                         - Température : ébullition                         - Durée de l’ébullition : environ 3 min                         - Volume mis en réaction : 3 x 20 = 60 mL   - Quantité de glucide comprise entre 2 limites                  - Nature du glucide                  - Alcalinité du milieu + H2O

6 L'étalonnage de la liqueur de Fehling est fait à l'aide d'une solution étalon de glucose à 3 g/L.
Dans un ballon de 250 mL, verser: - 10 mL de solution cuivrique - 10 mL de solution tartro-sodique Ajouter 2 grains de pierre ponce. Agiter. Porter à ébullition, puis verser goutte à goutte la solution étalon de glucose (contenus dans la burette), en maintenant l'ébullition. Observer la décoloration progressive du surnageant (laisser décanter le précipité de Cu2O). Poursuivre jusqu'à la décoloration totale (surnageant incolore) ou léger excès (surnageant légèrement jaune) Soit V1 mL la chute de burette.

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8 miel Glucose V2 V1 Liqueur de Fehling Liqueur de Fehling Ebullition Ebullition

9 miel Glucose Même chute de burette : Dilution de la solution la plus concentrée Liqueur de Fehling Liqueur de Fehling Ebullition Ebullition

10 miel Glucose 3 dosages glucose 3 dosages miel V1 ≈ V2 Liqueur de Fehling Liqueur de Fehling Ebullition Ebullition

11 Dosage enzymatique

12 Fig. 1. Representation of the GOD reaction (itt et al., 2000).

13 Peroxydase H2O2 + o-Dianisidine > o-Dianisidine oxydée (Accepteur d'O2, (coloration brune) Non coloré)

14 Glucose oxidase from P. amagasakiense showing the FAD moiety, indicating the key conserved active site residues

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17 Technique utilisé pour mesurer la concentration, en glucose dans le sang
Glucose oxidase : Glucose oxydase On le retrouve dans les cosmétiques, notamment naturels et bio. • SON ROLE. un stabilisant (ou agent stabilisateur) qui améliore la stabilité et la durée de vie des ingrédients ou des formulations. Propriétés antioxydantes, antibactérien. • SON ORIGINE. Biotechnologique, principalement présente dans les sources microbiennes et généralement obtenue par la fermentation, en milieu de culture, de champignons comme l’Aspergillus niger. • À SAVOIR. La glucose oxydase = additif alimentaire (dans les bières, laits, fromages, boissons sucrées, farines…), aux mêmes fins qu’en cosmétique, sous l’appellation de E1102.

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19 Chromatographie sur couche mince (CCM)
Premier  cas  de  figure:  on  souhaite  dénombrer  les espèces  chimiques  présentes  dans  un  échantillon ou tester la pureté de celui­ci Par exemple :  ­  Combien  d’espèces  chimiques  différentes  y  a­t­il dans un colorant alimentaire rouge ?  ­ La  vanilline  synthétisée  par  un  industriel  est­elle pure ? (la  molécule  de  vanilline  est­elle  bien  toute seule ?) → dans  ce  cas,  on  sépare  les  espèces  par chromatographie  et  l'étude  du  chromatogramme obtenu permet de les compter et si nécessaire de les comparer  avec  les  espèces  présentes  dans  d'autres mélanges. 

20 Deuxième  cas  de  figure:  on  suppose  qu’une espèce  chimique  bien  définie  est  présente  dans un mélange
 Par exemple :  ­ Un médicament sur lequel est indiqué « Contient de l’aspirine » en contient­il  vraiment ?  ­ L’échantillon d’arôme de menthe que  l’on vient de  synthétiser  contient­il  bien  la  molécule attendue ? on  cherche  à  mettre  en  évidence  l’espèce chimique  recherchée. Dans ce cas, on  réalise par chromatographie  une  comparaison  entre l'échantillon  testé  et  un  échantillon  de  référence  (échantillon dont on est sûr qu’il contient l'espèce chimique  dont  on  suppose  la  présence  dans l’échantillon testé) 

21 Séparation des constituants par un mécanisme d’échange soluté/phase mobile/ phase stationnaire
Le mélange est fixé sur un support appelé phase stationnaire (un gel de silice déposé en couche mince sur une plaque d'aluminium). Il est entraîné par un solvant approprié ( phase mobile ou éluant) qui migre par capillarité sur la plaque. Les constituants du mélange se séparent par migration différentielle : chacun d'eux est d'autant plus entraîné par l'éluant qu'il est plus soluble dans celui-ci et moins adsorbé sur la phase stationnaire.

22 Après migration les taches doivent être révélées ; c'est la détection qui peut se faire soit :
Pulvérisation d'un réactif caractéristique Par immersion dans un bain de permanganate de potassium Par pulvérisation de vapeur de diiode Par observation à la lumière UV si la plaque de silice comporte un indicateur de fluorescence

23 Mode opératoire 1) Préparation de la cuve : a. L'atmosphère de la cuve doit être saturée en vapeur d'éluant. Ceci impose d'avoir une cuve bien fermée et préparée un certain temps à l'avance. b. Le niveau de l'éluant au fond de la cuve doit être de 5 à 8 mm.

24 2) Les Plaques de CCM : a. La couche d'adsorbant est fragile, éviter de mettre les doigts sur les plaques. b. Repérer à l’avance l’emplacement où seront effectués les dépôts. Pour cela, tracer un léger trait de crayon parallèle au bord inférieur de la plaque à une distance de 2 cm. Les dépôts seront effectués sur cette ligne, à 1cm du bord de la plaque et espacés de 1cm.

25 3) Dépôt du mélange : a. Les solutions avec lesquelles on va réaliser les dépôts doivent être des solutions diluées. b. Pour effectuer les dépôts, on utilise généralement des tubes capillaires en verre ou des « piques à apéritif » dont le bout a été écrasé. c. Il faut déposer la solution pendant une durée très brève afin d'éviter l'étalement du dépôt. d. Ne pas trop appuyer, pour ne pas détériorer la couche d'adsorbant. 1

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27 Exemple d'élution en chromatographie sur couche mince
Rf = rapport frontal = 𝐿1/𝐿2

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29 6) On détermine le ratio frontal Rf = L1/L2
étant le rapport entre la distance parcourue par le soluté divisé par la distance parcourue par le front du solvant.

30 Dépôts Utiliser des micropipettes de 5 µL (Une micropipette n’est utilisée que pour déposer une seule solution). Le dépôt ne doit pas excéder un diamètre de 4 mm (à cause de l'étalement de la tâche au cours du développement). Effectuer les dépôts en deux fois, en séchant entre chaque opération. Déposer les témoins (xylose, lactose, maltose, glucose de concentration 2 g/L), les mélanges A et B à analyser et l’échantillon biologique.

31 Développement du chromatogramme
Mettre la plaque dans la cuve Laisser le développement se poursuivre jusqu'au moment où le front du solvant atteint environ 1 cm du bord supérieur de la plaque Sortir la plaque, la placer horizontalement, marquer légèrement au crayon de bois le front du solvant Sécher à l'air, terminer à l'air chaud

32 Révélation sous la hotte
De façon non spécifique par le réactif de Molish (α-naphtol + H2SO4 en solution éthanolique) Faire tremper quelques secondes la plaque dans le réactif ( sous hotte) Mettre à l'étuve 15 min à 100°C Entourer les taches au crayon de bois et identifier les taches à l’aide des témoins

33 Oses + H2SO4 Furfural ou hydroxyfurfural + a-naphol Complexe coloré