Mesure de spectre de fluctuations de vésicules

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1 Mesure de spectre de fluctuations de vésicules
géantes par analyse de contours ; application aux membranes passives et actives Jacques Pécréaux

2 De la membrane cellulaire à la vésicule géante
(Thomas M. Terry)

3 Un système modèle pour les physiciens

4 Plan de l'exposé Rappels sur la physique des membranes
Reconnaissance de contours Résultats Validation sur les vésicules passives Résultat membranes actives Conclusion

5 Théorie des membranes

6 Modèle physique L= q z y x -1
Canham, P. B. (1970). J. Theor. Biol. 26: 61-81, Helfrich, W. (1973). Z. Naturforsch. C 28: x y z L= q -1

7 Spectre de fluctuations
k module de rigidité de courbure s tension Helfrich, W. et al. (1984). Il Nuovo Cimento 3D(1):

8 Présence d'inclusions (protéines) dans la membrane
Ramaswamy, S. et al. (2000). Physical Review Letters 84(15): ~ ) , ( 4 2 ^ + - q kT t u e k s X = c

9 Membranes actives (J. Prost et al)
[ ] ) ~ )( ( , 2 4 ^ + X - q w P kT t u e a k s c = r F Manneville, J.-B. et al. (2001). Physical Review E 64(2): Prost, J. et al. Europhysics Letters 33(4):

10 Expériences de micropipettes sur les membranes actives :

11 Système expérimental : vésicules contenant de la bactériorhodopsine
Pompe à protons photoactivable (abs. max = 570 nm) Pompage de H+ (cycle 5ms) vert Þ pompage rouge Þ pas de pompage Luecke, H. et al. (1999). Science 286: Bicouche lipidique (EPC) Vésicule Géante 10-50 mm BR Rouge Þ passive Jaune Þ active H+

12 ln s = 8 p k kT D a ÷ ø ö ç è æ X - + c ~ w P 7 , £ theor
Manneville, J.-B. et al. (2001). Physical Review E 64(2): Excès d’aire du aux fluctuations A p F 1 2 3 4 5 Da (%) active passive ln(s) ln s = 8 p k kT eff D a T 85 . 1 : exp ÷ ø ö ç è æ X - + c ~ 2 w P e 7 , theor Rv 2Rp DL DP DIC Pa estimé ~ 4×10-20 J Activité Amplification des fluctuations

13 Vers l'analyse de contours
Des Expériences de Micropipettes... Mesure de la température effective seulement Pertubent le système ...A une mesure du spectre de fluctuations

14 Simulations : effet de la concentration
Simulations : effet de la tension Simulations : effet du dipôle Pa i 4×10-20 J.m 3×10-20 2×10-20 1×10-20 0.5×10-20 r i 1.5×1016 m-2 7.5×1016 1.5×1015 7.5×1014 1.5×1014 s h 10-9 N/m 10-8 10-7 10-6 10-5

15 Objectifs Mesure d’un spectre de fluctuations jusqu’à grands vecteurs d’onde Qui s’applique loin de la forme sphérique Résultats interprétables avec une théorie en membrane plane

16 Deux techniques de reconnaisance et d'analyse de contours existantes

17 Reconnaissance d'objet sphérique
Permet d’accéder à un spectre de fluctuation Analyse assez fine Ne s’applique qu’aux objets sphériques Nécessite une théorie en harmoniques sphériques Mitov, M. D. et al. (1992). Advances in Supramolecular Chemistry. Gokel. Greenwich (Connecticut), Jai Press. 2:

18 Reconnaissance de formes
Analyse de Contours : ce qui existait Reconnaissance de formes Wilson, T. et al. (1981). Optik 59(1): Permet la reconnaissance de formes non sphériques, et leur analyse Limitée aux petits vecteurs d’onde, pas réellement de mesure du spectre Döbereiner, H.-G. et al. (1997). Physical Review E 55:

19 Notre méthode de reconnaissance
de contours

20 Dispositif expérimental
Reconnaissance de Contours : notre méthode Dispositif expérimental Pécréaux, J. et al. (2004). European Physical Journal E (accepted).

21 Détection de Contours : stratégie générale

22 Détails de l'analyse de contours

23 Analyse d'une série de contours

24 Spectres obtenus

25 Notre méthode d'analyse
de contours

26 Utilisation de theorie sur des membranes planes
Passage des séries de Fourier aux transformées de Fourier

27 Coupe par le plan diamétral
Pour une membrane plane à 3D Helfrich, W. and R.-M. Servuss (1984). Il Nuovo Cimento 3D(1): Pour la coupe d’une Membrane plane

28 Effet du temps d'intégration
avec On ne peut pas négliger l’effet du temps d’intégration

29 Effet de la gravité Négligeable pour
Henriksen, J. R. et al. (2002). European Physical Journal E 9:

30 Détection à résolution finie ; correction

31 La reconnaissance et l'analyse de contours permettent
La mesure d’un spectre de fluctuation jusqu’à de grands modes (n=35) par rapport aux techniques précédentes (n=10-15) L’utilisation d’une description théorique en membrane plane (et donc en transformée de Fourier) La prise en compte de l’intégration en temps Une mesure non intrusive du spectre de fluctuations

32 membranes passives

33 Buts Valider notre méthode de mesure du spectre de
fluctuations en retrouvant des valeurs raisonnables des paramètres physiques des vésicules Développement de l’analyse spécifique Réalisation d’expériences sur EPC, SOPC, et SOPC:CHOL

34 Résultats SOPC 10 -21 -20 -19 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 x10 6

35 Valeurs Publiées du module de rigidité de courbure
Lipide Module de Courbure Déviation Standard Valeurs Publiées du module de rigidité de courbure EPC 4.25 0.87 6.6 Méléard, P. et al. (1998). Biochimie 80: 11.5 Duwe, H.-P. et al. (1990). Journal de Physique France 51: 2.5 Kummrow, M. e al. (1991). Physical Review A 44(12): SOPC 12.6 2.6 12.7 Méléard, P. et al. (1998). Bioch. 80: 12.7 Döbereiner, H.-G. et al. (2003). PRL 91(4): 9 Evans, E. et al. (1990). Physical Review Letters 64(17): SOPC:CHOL 1:1 29.6 3.3 24.6 Evans, E. et al. (1990). Physical Review Letters 64(17):

36 Conclusion Notre méthode permet une réelle mesure du
spectre de fluctuations et permet pour la première fois un “fit” du spectre Bon accord entre nos résultats et les valeurs des modules de rigidité de courbure trouvés par d’autres auteurs Valeurs de la tension raisonnables

37 membranes actives

38 Buts Mesurer l’effet de l’activité hors équilibre de pompe
Sur les fluctuations de la vésicule ? Théorie : amplification des fluctuations et un nouveau spectre de fluctuations Manneville, J.-B. et al. (2001). PRE 64(2): Prost, J. et al. (1996). EPL 33(4): Experience : Préparer un système contrôlé de vésicules actives et effectuer la mesure du spectre de fluctuations

39 + Solution de lipides et de BR en éther H+ 200 nm
Girard, P., J. Pécréaux, et al. (2004). Biophys. J. (submitted). + 200 nm Solution de lipides et de BR en éther H+

40 Résultats : présence de la protéine
SOPC/BR=1150 Fit membrane passive SOPC Fit membrane lipidique SOPC/BR=230 Fit membrane passive

41 Résultats : un effet du gradient ?

42 Résultats : activité de la protéine ?
SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 SOPC/BR=230 FCCP

43 Conclusions sur les membranes actives
Expérimentalement On detecte l’effet de la présence de la protéine passive. On est capable de détecter l’activité de la protéine à partir d’une modification du spectre Le modèle théorique est insuffisant pour rendre compte des observations Différences avec les observations de J-B Manneville Mais Perspectives Mener des expériences complémentaires Développements théoriques en vue de comprendre les mesures sur les membranes actives Mesure avec d’autres pompes

44 Membranes hors-équilibre par apport de lipides
Collaboration avec J. Solon Mise en évidence d’une tension négative

45 Conclusions et perspectives
Mesure du spectre de fluctuation à la fois précise et rapide, validée par des mesures sur des membranes passives Mesure de spectres de membranes hors-équilibre moyennés sur des temps longs Mesure de phénomènes à dynamique rapide Reconstitution de la BR en liposomes géants par une méthode générale Gamme de tensions accessibles ( N/m) Limite en vecteur d’onde q<4×106 m-1 Mesures en diffusion de lumière pour accéder à des vecteurs d’onde plus grands

46 Merci à La Protéine, reconstitution en petits liposomes et test,
marquage FITC J.-L. Rigaud D. Levy P. Girard Travaux théoriques sous-tendant cette étude J. Prost J.-F. Joanny D. Lacoste (PCT, ESPCI) Bases sur la reconnaissance et l’analyse de Contours H.-G. Döbereiner (Golm, Germany) Expériences de Micropipettes J.-B. Manneville

47 Mesure de spectre de fluctuations de vésicules
géantes par analyse de contours ; application aux membranes passives et actives Jacques Pécréaux

48 Membranes hors-équilibre par apport de lipides
Collaboration avec J. Solon