Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica

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2 Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica
Bordetella beta- protéobactérie bronchiseptica Coccobacille gram négatif, mobile aérobie S et N + tractus respiratoire présent chez de nombreux mammifères responsable de bronchopneumonie chez les animaux zoonose possible parent de B. pertussis et B. parapertussis génome séquencé (5.3Mbase) Bordetella ssp. facteurs de virulence (adhesines et toxine) exprimées sous le contrôle d’un système à 2 composants (BvgAS system) nécessité d’un TTSS pour induire la cytotoxicité, la colonisation à long terme de la trachée

3 Le pouvoir pathogène de la bactérie Bordetella bronchiseptica
BvgAS système: BvgS: protéine membranaire histidine kinase senseur du milieu extracellulaire activée , phosphoryle BvgA BvgA: facteur de transcription pour les gènes de virulence régulation du TTSS Système de sécrétion de type 3 : très conservé chez les bactéries Gram- un des mécanismes très impliqué dans la virulence translocation des effecteurs du cytosol de la bactérie dans le cytoplasme de la cellule hôte selon le stade de l’infection, les effecteurs peuvent variés

4 Représentation d’un TTSS
Protéines sécrétées via le TTSS : 4 protéines identifiées chez Bordetella. BopB, BopD, BopN et Bsp22 BopB/D complexe de perforation de la membrane plasmique BopN ATPase permettant la sécrétion Objetif de l’étude: Identifier de nouveaux effecteurs de Bordetella passant via le TTSS

5 Recherche de protéines sécrétées via le TTSS
-Comparaison des profils protéiques des surnageants de culture des souches wt et ΔTTSS en SDS-PAGE 10 bandes différentes entre les 2 pistes dont BopB, BopN, BopD, Bsp 22 -Extraction du gel des 6 bandes non identifiées -Trypsination et analyse par spectromètre de masse pour identification des protéines MALDI-TOF MS ou ESI-MS/MS -génération in silico d’une banque de peptides à partir du génome

6 Recherche de protéines sécrétées via le TTSS
-Analyse des séquences peptidiques: 3 bandes sont des produits de dégradation de Bsp22 et BopD Bande a 1 peptide résidus de HP p69 Bande b 5 peptides Une seule protéine a été identifié à l’issue du screening. HP de 69 kDa renommée BopC

7 Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?
Génération d’un mutant ΔBopC Clonage puis délétion du gène bopC via le système Gateway™ Introduction dans un plasmide suicide conjugatif (pRK6) Complémentation du mutant ΔBopC par le plasmide pBopC Clonage d’une cassette promoteur fha- bopC- terminateur rrnB1 fha hémagglutinine filamenteuse de Bordetella activé par BvgA Introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415)

8 Les bandes a (150kD) et b (28kD) correspondent –elles à une seule protéine BopC?
Comparaison des profils de sécrétion formation de complexe multimérique sécrétion dépendante d’un TTSS

9 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules L2 de rat pendant 20 min Coloration avec une solution de Giemsa (différenciation nucléaire et cytoplasmique) 95% des cellules infectées par les témoins + sont détruites Pas de cellules dégradées pour les mutants ΔbopC et ΔTTSS

10 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules HeLa Evaluation de la cytotoxicité par mesure de la LDH La cytotoxité de B. brochiseptica est associée à bopC.

11 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Recherche d’un effet cytotoxique de BopC Infection de cellules HeLa pendant 1h Evaluation de la mortalité par coloration au bleu trypan 57% 48%

12 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Données bibliographiques B. brochiseptica induit une nécrose des cellules sans activation des caspases Cependant, observation de certaines cellules infectées TUNEL + (terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP-biotin nick end-labelling) Coloration différentielle de la mort cellulaire: Cellules apoptotiques coloration dense au niveau du noyau Cellules non apoptotiques: coloration diffuse du noyau

13 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
Evaluation de la mort cellulaire Observation des cellules HeLa infectées à 2h (ou 5h pour la stauroporine) BopC est requis pour l’induction de la mort cellulaire, mais n’induit pas d’apoptose. Stsp: staurosporine, inhibiteur des PK

14 BopC a-t-elle un effet cytoyoxique?
BopC est-elle une protéine formant un pore du TTSS? Mesure de l’activité hémolytique (30min de contact) Contrairement à BopB/D, BopC n’appartient pas au complexe de perforation de la membrane plasmique

15 BopC et phosphorilation
Données bibliographiques B. brochiseptica induit des déphosphorylations dans des cellules L2 infectées. Ce phénomène est TTSS dépendant. Recherche d’un effet de BopC sur les protéines tyrosine phosphorylées (PY). Observation par immunofluorescence de différents facteurs: adhérence bactérienne ( actine et bactérie) Etat de phosphorylation des PY

16 BopC et phosphorilation
Observation des cellules HeLA après 0, 20 min ou 1h d’infection

17 BopC et phosphorilation
Au cours du développement de l’infection: l’adhésion et la colonisation des cellules ne sont pas modifiées chez les mutants ΔbopC et ΔTTSS. l’état de phosphorylation des PY est modifié par la souche wt mais ni par le mutant ΔbopC, ni par le mutant ΔTTSS BopC induit une déphosphorylation des PY dans les cellules infectées.

18 BopC et phosphorilation
Au cours du développement de l’infection B. brochiseptica BopC : requis pour l’induction de la mort cellulaire modifie l’état de phosphorylation des PY Sur quel aspect BopC agit principalement? Infection de cellules HeLa en présence d’inhibiteur de la déphosphorylation, le sodium orthovanadate Observation en microscopie à fluorescence Mesure de la cytotoxicité (LDH et TUNEL)

19 BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica wt en présence ou non de vanadate + - L’état de déphosphorylation des PY dans les cellules en présence de vanadate est relativement atténué.

20 BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate Observation sur 200cellules au hasard La présence de vanadate atténue la déphosphorylation des PY induite par BopC.

21 BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate

22 BopC et phosphorilation
Infection de cellules HeLa par B. brochiseptica en présence ou non de vanadate Le vanadate et donc l’état de déphosphorylation des PY n’ont pas d’effet sur la cytotoxité cellulaire. ↓[PY] dans les cellules infectées par B. brochiseptica a lieu après la mort cellulaire dépendante de BopC.

23 BopC et sécrétion via le TTSS
Données bibliographiques Les effecteurs TTSS dépendants sont introduits directement dans la cellule hôte depuis le cytoplasme bactérien via le TTSS. BopC est-elle un effecteur de type III? Utilisation d’un système rapporteur TEM-1 β-lactamase ( Charpentier et Oswald, 2004) Fluorescence Resonance Energy Transfert

24 BopC et sécrétion via le TTSS
Génération des fusions TEM1 Amplification PCR des gènes bopC, bcrH2 (protéine cytoplasmique induit par BvgA) et map (effecteur de EPEC) Clonage dans le pCX340 (fusion traductionnelle avec TEM1) puis PCR pour introduction dans un plasmide réplicatif conjugatif (pRK415) via le système Gateway™,

25 BopC et sécrétion via le TTSS
Analyse des transformants ΔbopC et ΔbopB et ΔTTSS avec les plasmides TEM1 Protéines totales Protéines sécrétées 5% 20% Les produits de fusion BopC-TEM1 sont correctement synthétisés et sécrétés exceptés dans la souche ΔTTSS.

26 BopC et sécrétion via le TTSS
Cellules HeLa infectées+ CCF2-AM 70% FRET+ BopC est transloquée via le TTSS dans la cellule hôte. Le signal d’adressage se situe dans les 48 premiers acides aminés N-ter.

27 BopC et cytotoxicité dans la cellule hôte
BopC a un effet cytotoxique mais est-il direct ou résulte –t- il d’une cascade de régulation? Clonage de BopC dans un plasmide d’expression eucaryote Transfection des cellules COS-7, HeLa, 293T Mesure de la cytotoxicité à 18h L’expression de BopC directement dans la cellule permet d’induire la mort cellulaire sans intervention d’autres facteurs de virulence.

28 Discussion BopC (Bordetella outer protein involved in cytotoxicity)
protéine de 69kDa impliquée dans la mort cellulaire protéines sécrétées via le TTSS : pore forming proteins (translocators) (1) ou effecteurs (translocated protéins) (2) effecteur de cytotoxicité qui provoque la nécrose des cellules infectées. Analyse in silico du gène bopC BopC a une fonction protein-tyrosine phosphatase (PTPase) comme YopH mais rBopC activité PTPase – membre de la famille PTPase activité catalytique sur la cystéine 403 dans YopH BopC n’a pas de cystéine L’effet PTPase ne serait pas lié à BopC

29 Discussion Analyse in silico du gène bopC
Recherche de protéines homologues et ou de motifs conservés Présent uniquement chez les souches de Bordetella (identité >95%) Localisation à l’extérieur du locus TTSS idem pour d’autres effecteurs de TTSS (SopE, SigD, orf3,Nle5) Recherche d’îlots de pathogénie dans une région de 20kb flanquant bopC transposase 5kb en amont de bopC B.parapertussis transposase 2kb en amont et intégrase 1.6kb en aval de bopC B. pertussis Rien chez B. bronchiseptica Régulation + de bopC par le système BvgAS

30 Discussion La protéine BopC
BopC est sécrétée sous forme de multimère ou compléxée ( kDa >69kDa) observation en SDS-PAGE de tels phénomènes pour des protéines ayant de nombreux segments TM mais BopC possède un seul TM prédit ( aa) la multimérisation de BopC serait porté par la partie Cter ( aa) de BopC BopC et TTSS Les TTSS peuvent sécréter des effecteurs hétérologues: Xanthomonas TTSS reconnaît YopE; Yersinia TTSS reconnaît Pseudomonas AvrB et AvrPto; Bordetella TTSS reconnaît EPEC Map bien que moins stable ( absence de la chaperone CesT) BopC aurait un effet régulateur sur l’expression des autres protéines du TTSS

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32 La spectrophotométrie de masse
MALDI-TOF Matrix –assisted laser desorption/ionization Time of Fly ESI Electrospray Ionization

33 Phage lambda recombination in E. coli
cos The Gateway® System relies on five sets of specific and non cross-reacting att sequences Phage l attP 232 bp x attB E. coli 21 bp The specificity is given by the 7 nucleotides of the core region Bacteriophage lambda att site recombination is a well-characterized phenomenon. In bacteria, there is a stretch of DNA called attB, (B stands for bacteria), and in the phage there is a stretch of DNA called attP (P stands for phage). When the phage infects a bacterium, the injected lambda DNA recombines with the corresponding bacterial DNA via the att sites in the presence of integration-specific enzymes. When an attB site recombines with an attP site, the outcome is integration of the phage DNA into the bacterial genome. Once integrated, the hybrid recombination sites are called attL and attR (L stands for left, R stands for right). These recombination reactions (“LR” and “BP”) are the basis of the Gateway® Cloning System If the phage undergoes the lytic phase, phage DNA can excise itself from the bacterial DNA. In the presence of a different set of recombination and excision enzymes, the attL site recombines with the attR site, resulting in phage DNA separation from the bacterial genome. Integration (Int, IHF) Excision (Int, IHF, Xis) attL attR Lysogen 96 bp 157 bp

34 Glossary of terms used in Gateway® cloning
att site – A defined length of DNA that constitutes a recombination site. There are 4 classes of att sites called attB, attP, attL, and attR. ccdB gene – A counterselectable gene that allows for negative selection of unwanted by-product plasmids after recombination. Donor (pDONR) Vector – A vector with attP sites flanking a counterselectable gene that recombines with a gene of interest flanked by attB sites. BP reaction – A recombination event between attB and attP sites catalyzed by BP Clonase™ II Entry (pENTR) clone – A vector that contains your gene of interest flanked by attL or attR sites. LR reaction – A recombination event between attL and attR sites catalyzed by LR Clonase™ II Destination (DEST) Vector – An application-geared vector with attR sites flanking a counterselectable gene that will recombine with one or more entry clones. MultiSite Gateway® Technology – A system that allows simultaneous assembly of multiple DNA fragments into a single destination vector

35 Building a Gateway® Entry Clone
+ + BP Clonase™ II 90-99% correct clones on Kan plates Obtaining a Gateway® Expression Clone 90-99% correct clones on Amp plates + LR Clonase™ II The Gateway® in vitro recombination system relies on 5 artificial, orthogonal att sequences. That is 5 of each attP, B, L, and R sequences that work in parallel. The specificity is determined by a unique, 7 bp core sequence that allows minimal crossreactivity among att sequences. In the BP reaction, the attB site reacts with the attP site to create attL and attR sites, as depicted. Note that attB1 will only react with attP1 and not attP2, ensuring the directionality of the reaction. To generate the entry clone, two of these artificial short attB sequences (attB1 and attB2) must be added to specific primers that are used to amplify the gene of choice. The DNA fragment is combined with a donor vector that contains attP1 and attP2 sequences and a counterselectable marker, ccdB. Upon addition of BP Clonase™ the entry clone is produced along with a by-product fragment containing ccdB. Due to the presence of the kanamycin resistance gene in the donor vector, Entry clones are selected on plates containing kanamycin. The BP recombination process is highly efficient, usually producing >10,000 colonies per reaction. Of the total number of colonies obtained, greater than 90% of the colonies contain the entry clone with the gene of interest in the correct orientation.

36 CTGCTTTTTTGTACAAACTTG attB1 CAGCTTTCTTGTACAAAGTTG attB2 CAACTTTATTATACAAAGTTG attB3 CAACTTTTCTATACAAAGTTG attB4 CAACTTTTGTATACAAAGTTG attB5 Standard Gateway® MultiSite Gateway®

37 2-fragment MultiSite Gateway® Pro
PCR Fragments attB1 attB5r attB5 attB2 X X X X pDONRs attP1 attP5r attP5 attP2 BP reactions attL5 attL2 Entry Clones X attL1 attR5 X In MultiSite Gateway® and MultiSite Gateway® Pro, entry clones are also constructed via BP recombination but in order for them to have the correct configuration in the final LR assembly reaction, a combination of flanking attL and attR sites is used. This is facilitated by the modular nature of the att sites. A different set of pDONR vectors is required. In this example a 2-fragment recombination using MultiSite Gateway® Pro is shown. Here, by reversing the “standard”’ orientation of the attB5 site to an attB5r site in the PCR fragment, and by doing the same with its cognate attP5 counterpart in the donor vector, an attR5, instead of an attL5 is generated in one of the entry clones. The second entry clone bears a standard attL5 sequence that allows pairing with attR5 and the generation of an attB5 via LR recombination. This concept is key to the function of the MultiSite Gateway® system. To perform the LR reaction the entry vectors are mixed with an appropriate destination vector and LR Clonase™ II Plus. The reaction is incubated for 16 hours at room temperature and an aliquot is used to transform E. coli competent cells. Recombinants are selected using the destination vector’s antibiotic resistance. Destination Vectors attR1 attR2 LR reaction Expression clones attB1 attB5 attB2 Invitrogen Proprietary & Confidential

38 MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit
X attB1r attB4 attP1r attP4 attB2 attB1 attP2 attP1 attB3 attB2r attP3 attP2r PCR Fragments pDONRs BP reactions attL4 attR1 attR2 attL3 Entry clones X X attL1 attL2 Another MultiSite Gateway® strategy, called MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction kit enables the addition of 5’ and 3’ elements at both ends of standard attL1-attL2 entry clones (such as the Ultimate™ ORF clones). Note that in this case attR4-attR3 destination vectors are used. Destination vector attR4 CmR ccdB attR3 LR reaction attB3 attB4 attB2 attB1 Expression clone Invitrogen Proprietary & Confidential

39 Système TEM