Sécrétion des facteurs de virulence chez les bactéries GRAM négatives sophie bleves, romé voulhoux nawel ADJEROUD.

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1 Sécrétion des facteurs de virulence chez les bactéries GRAM négatives sophie bleves, romé voulhoux nawel ADJEROUD

2 Sécrétion Survie et Adaptation Protéines Enzymes Toxines Excrétion
Elimination de Déchets Survie et Adaptation

3 six systèmes de sécrétion
Extérieure M. Externe Processus Complexe Nécessite six systèmes de sécrétion Périplasme M. Interne Cytoplasme

4 Type VI

5

6 Vibrio cholerae Vibrio cholerae bactérie à gram négatif
(bacille virgule en français) Forme: bâtonnet incurvé, mobile responsable du choléra chez l‘homme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).

7 Sécrétion membranaire de toxine
AB5 S/unité A Système de sécrétion type 2 S/unité B5

8 Type II secretion system of V. cholerae:. ATPase: EpsE
Type II secretion system of V. cholerae: . ATPase: EpsE Plateforme MI: EpsE, L, F, M EpsD Sécrétion Exportation PetidaseEpsO Pseudopilins Pseudopilus (assemblageG)

9 Homologie T2SS-T4SS Pseudopilus Pilus Pseudopilins Pilins TYPE II TYPE IV

10 Bibliographie: Rôle de EpsG
Surexpression G Constants Apparition Pseudopilus à la surface eps Operon eps G All eps genes [EpsG] ATPase: EpsE Proteines Platforme MI

11 The Question is Comment? EpsG---EpsE EpsL Lien possible Lien
Direct/Indirect ??? G G G Comment? EpsG---EpsE

12 Pourquoi L: Linker ? L E-G E G Bibliographie:
Mutation en E supprime mutation en G Etude structurale E: a un site d’interaction avec L: E interagit avec G via L G-L L ? Lien E-G E G

13 Pour déterminer interaction EpsG-EpsL:
Méthodologie Pour déterminer interaction EpsG-EpsL: 1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking 2- Co-immunprécipitation

14 1. Pontage chimique (DSP)
Figer / immobiliser ces molécules Molécules en interaction « faible » (difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...), Ou simplement à proximité l’une de l’autre Pontage covalent entre les 2 molécules Agents de pontage DSP, imidoester bifonctionnel, glutaraldéhyde, formaldéhyde.

15 (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant
Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires. DSP+Pro Liaisons amides covalentes DSP-Pro1 Libération NH-ester DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product +Pro Pro1-DSP-Pro2 Réaction avec amine primaire

16 DSP 1 2 EpsL EpsG

17 2. Co-immunoprécipitation
Technique d’identification des interactions protéine-protéine: Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!

18 SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine
EpsG EpsL SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine

19 RESULTATS

20 Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
Sans EpsG ou L Absence G-L: Il existe bien interaction EpsL -- EpsG 60kDa 35kDa Dimère EpsG 15Kda

21 Mesure activité Protéase
Contrôle: Mesure activité Protéase Mutations epsL et epsG pas de sécrétion de protéase: complexe G-L nécessaire sécrétion Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu

22 Confirmation Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
Délétion d’epsG ou epsL Absence du complexe EpsL-EpsG

23 Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG
Lanes 4, 6 Augmentation EpsG et complexe G-L Lanes 7, 9 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

24 2. Immunoblott pour EpsG

25 Augmentation EpsL et complexe G-L
3. Immunoblott pour EpsL Lanes 7, 9 Augmentation EpsL et complexe G-L Lanes 4, 6 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

26 4. Immunoblott pour EpsL

27 1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG
Mutation pilD Pas de complexe G-L EpsG non clivée de PM élevé Clivage PilD Nécessaire au G-L

28 2-Clivage par PilD: sur Mutant G
Dans pEpsGG-1V Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion Clivage EpsG par PilD est nécessaire au cross-link avec EpsL

29 Lien direct/indirect 1. Rôle des autres membres T2S….???
Seule EpsL est essentielle à la formation G-L EpsL EpsG Interagissent Directement

30 2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour G
G-L formé En présence de EpsG EpsL E. coli Aucune protéine de V.cholerae est impliquée G se lie de préférence à L qd L est présent

31 3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour L
Association EpsG-EpsL spécifique

32 Effet Mutation T112, D91 de EpsG…???
Liaisons H Asp91-Thr112 G devient moins stable

33 Substitutions T112 D91de EpsG WT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG
Absence G-L si résidus G substitués (D91E, T112L) Pas de Sécrétion si Résidus substitués: domaines conservés Chez ts homologues

34 Conclusion

35 Apport de l’article…? EpsL: Scaffold transduction de signaux entre E-G ‘‘Linker’’ de l’ATPase:EpsE-EpsG: conversion énergie Etude interactions EpsG-EpsL cross-link (1pseudopilin Majeur-le reste duT2SS) L’hydrolyse ATP: Changement dynamique de E Qui affecte L Qui permet assemblage de G L’association EpsL-EpsG est spécifique: sans aucun autre composé T2SS. EpsG clivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL. Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins Interactions EpsE-EpsL

36 Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP)
EpsD OM Pseudopilus Exportation de toxine Clivage PilD C filaments en Hélice M EpsL Peptidase PilD G G G Sec IM EpsF EpsE G T G ATP ADP +Pi G T G T G G The conversion of chemical energy to mechanical work: Polymérisation des G Pseudopilins G G

37 Sécrétion de toxine chez V. cholerae
Piston

38

39 Futures Etudes.…? Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et EpsL. Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils ‘‘recrutés’’ eux aussi par EpsL par hydrolyse d’ATP? Pour être incorporer dans le pseudopilus. Comprendre réelement l’implication des interactions EpsG-EpsL (hydrolyse d’ATP et ???)

40 Des questions???.... Des commentaires???....
De votre attention Des questions???.... Des commentaires???....