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Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes Les Îlots de pathogénicités (PAI) Denis Dacheux-Deschamps.

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1 Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes Les Îlots de pathogénicités (PAI) Denis Dacheux-Deschamps

2 Les Îlots de pathogénicités (PAI)

3 Le monde bactérien 5000 espèces de bactéries décrites, à espèces bactériennes estimées, 200 sont pathogènes pour lHomme. séquençage exponentiel des génomes de Bactéries pathogènes ou non Transferts de gènes via la conjugaison, la transduction et la transformation. Génome bactérien : « partie centrale (cœur) et partie flexible »

4 Génome procaryote Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

5 Genomic Islands Hacker and Carniel 2001 EMBO rep. > 10kb PAI

6 Genomic Islands Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

7 int : gènes dintégrase ; vir : gènes de virulence ; mob : gènes de mobilisation E. coli puis nombreuses bactéries Gram + ou Gram – (pathogènes de plantes ou animaux) 10 à 200 kb, % G+C différent, extra- ou intrachromosomique, PAI absent chez les bactéries non pathogènes de la même espèce Îlots de Patogènicité (PAI) intvirAvirBvirC mobAmobB Pathogène Non-Pathogène tRNA

8 Fonctions associés aux PAI Hacker and Carniel 2001 EMBO rep.

9 Gènes de virulence associés aux PAI Adhésines ex : intimine adhérence intestinale pour EPEC/EHEC (attachement effacement) Système de sécrétion Principalement le SS de type III (TTSS) et le type IV Invasines, modulines Ex : Salmonella 5 PAI (SPI) SPI-1 invasion C. épithéliales SPI-2 intracellulaire prolifération SPI-3&-4 intramacrophage survie SPI-5 inflammation et sécrétions intestinales Toxines Pore forming : hémolysine (UPEC), listériolysine O (Listéria sp) Protéase, lipase, enterotoxine, ADP ribosilation (prot G) Superantigène Système capture du fer Récepteur au fer : sidérophores (yersiniabactine…) Autres Résistance sérum, apoptose, IgA protéase, gènes inconnus

10 Régulation des PAI Gènes de régulation codés par le PIA ou extérieur : Activateur de transcription type AraC (TTSS ExsA ; VirF 37°C Yersinia) Régulateur de réponse à deux composants (PhoP/PhoQ, Mg 2+, SPI-1) Facteur sigma Histones +

11 Sites intégrations des PAI 75% des PAI insérés en 3 des ARNt DR: direct repeat pb parfois similaire au site att des phages ou IS (élément dinsertion) DR

12 Intérêt des tRNA Plusieurs copies du gène ARNt selC ARNt (selenocystéine) le plus ciblés Utilise souvent le promoteur Gène ARNt non indispensable (ex selC ARNt) Insertion ancestrale des phages ou plasmides

13 Mobilité des PAI Intégrase, recombinase généralement codées par le PAI Souvent par transduction (lors dinfection) (supposé) Intra-chromosomique (Yersinia), Intra-espèce, Inter-espèce (supposé) perte mobilité (mutation, délétion) ….Évolution

14 Évolution des PAI Hacker and Kaper 2000 Annu. Rev.Microbiol.

15 Le système de sécrétion de type III (TTSS) chez les bactéries pathogènes

16 Les facteurs de virulence bactérienne Antibiotiques Phagocytose Exopolysaccharide Adhésion cellulaire Flagelle Pili Survie et multiplication dans lhôte Type III Phospholipase Elastase Type II Exotoxine... Systèmes de sécrétions protéiques Type I Protéase alcaline... Type IV CagA... Plasmide Ti Type V Auto- tranporteur

17 Les différents systèmes de sécrétion des bactéries Gram-négatives Nombreuses protéines bactériennes sécrétées, dactivités diverses dont des facteurs de virulence. Type I à V (I et III sec indépendant) Exportation, sécrétion, translocation

18 Le système de sécrétion de type III (TTSS) Injection dans le cytoplasme de la cellules Eucaryotes (Translocation) de protéines bactériennes toxiques. Contact physique Cellules - Bactéries Toxines injectées homologues à des protéines Eucaryotes agissant sur les voies de signalisation.

19 La sécrétion de type III chez les bactéries Gram-négatives Pseudomonas syringae, Erwinia spp., Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Rihzobium spp. Phyto-Pathogènes : Identifiée chez de plus en plus de bactéries pathogènes Pathogènes danimaux : Intracellulaire Extracellulaire

20 Burkholderia Yersinia YopP/J YopE YopT YopH YopM P. aeruginosa ExoT ExoS ExoY ExoU dactine Cytosquelette MAP Kinase Inflammation EPEC Tir EspB SipB SipC SopB SipA SopE Salmonella La sécrétion de type III chez les pathogènes animaux IpaA IpaB Shigella Intracellulaire Extracellulaire Bortedella BopC Mort cellulaire Caspases NF-kB

21 Complexe isolé (Kubori et al., 1998, Science) Isolation du système de sécrétion de type III Structure du complexe inséré dans la paroi bactérienne (Sukhan et al., 2001, J. Bac)

22 Purification du complexe Injectiosome » (« seringue + aiguille = Injectiosome ») (Kimbrough et Miller 2000, PNAS) (Blocker et al., 2001, Mol. Mic) Salmonella typhimurium Shigella flexneri schema Yersinia enterocolitica (Cornelis 2002, Nature)

23 Diversité des systèmes de sécrétion de type III bactériens

24 nm Structure de lappareil de sécrétion de type III « Injectiosome » à 4 nm Appareil de translocation « Translocateur » Appareil de sécrétion Membranes bactérienne Cytoplasme bactérien Effecteurs toxiques type III

25 Organisation génétique des gènes codant lappareil du TTSS Gènes regroupés en « cluster » ou « îlot de pathogénicité » (PAI). Cluster de gènes présent soit sur le chromosome bactérien ex: S. typhymurium, P. aeruginosa, EPEC soit sur un plasmide ex: S. flexneri soit sur les deux ex: Yersinia spp. Souches non pathogènes ne possèdent pas ces PAI. Gènes organisés sous la forme dopérons. Gènes de structure du TTSS très conservés entre différents pathogènes.

26 Gènes codant lappareil du TTSS (15 à 20 gènes) Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev. Animaux Végétaux

27 Modèle dassemblage du complexe TTSS Galan, 2001 Annu. Rev.Cell. Dev. Biol. Marlovits, 2006 Nature

28 (Calvin et al 2005, Nature) Caractérisation structurale de la base du TSS EscJ(EPEC)

29 Gènes codant les effecteurs bactériens injectés - sur plasmide de virulence associés aux gènes du TTSS. - ou dispersés sur le chromosome Gènes localisés à l'extérieur des clusters: Co-régulation transcriptionnelle avec les gènes de lappareil du TTSS. Protéines variant en taille, structure et fonction et espèces-spécifiques. Certains domaines des effecteurs sont homologues entre différentes bactéries. Effecteurs possédant des activités eucaryotes. (origine eucaryote)

30 Fonctionnement du TTSS 1. Appareil de sécrétion exprimé à la surface de la bactérie en position fermée par protéines. 2. Contact avec membrane cellule eucaryote, ouverture du canal, (position ouverte). 3. Sécrétion protéines du translocateur, par la canal sinsérant dans la membrane eucaryote (pore). Communication entre cytoplasmes bactérien et eucaryote. 4. Translocation des effecteurs protéiques dans la cellule cible.

31 Modèle générale du TTSS Blocker et al., 2000 Mol. Micro.

32 Exemple de Modèle du TTSS chez Yersinia spp. (Cornelis 2002, J.C.B.)

33 Régulation transcriptionnelle des gènes du TTSS Activateur transcriptionnel commun de type AraC, actif sur tous les opérons et gènes du TTSS (effecteur et structure). Régulateurs de réponse à deux composants espèce-spécifique. Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

34 Exemple de régulation transcriptionnelle P. aeruginosa pscpop exo exs C B A ExsA S. flexneri Yersinia spp. exsD -

35 Signaux dactivation transcriptionnelle in vitro Température : induction à 37°C (Yersinia, Shigella) Osmolarité (Shigella, Pseudomonas, Salmonella) pH : répression si inférieur à 7-8 (Shigella) activation si acide (Salmonella) Phosphate : (Salmonella) Oxygène : (Salmonella) Calcium/ Magnésium : répression (Yersinia, Pseudomonas, Salmonella )

36 Signaux dactivation transcriptionnelle ex vivo / in vivo Contact cellule-bactérie Pettersson et al, 1997 Science Y. pseudotuberculosis / HeLa

37 Signal de sécrétion des effecteurs via le complexe TTSS -15er AA Nter suffisant pour certaines protéines (ex: YopN) -pas séquence signal identifiée mais structure sur ARNm incluant AUG. NterCter 115AA Modèle ARNm -15ème au 100ème AA Nter reconnu par une protéine chaperonne. (ex YopE et SycE). 100 Modèle des chaperonnes

38 Les deux modèles de sécrétion Ribosome ARNm yop Répresseur traductionnel yop Récepteur ribosome Chaperonne Syc Protéine de fermeture Récepteur chaperonne Polypeptide yop Andersonet al, 1999 Trends Micro.

39 Les protéines chaperonnes 14 kDa pHi acide (4,4 à 5,2) Nter Cter séquence putative AA reconnue. à proximité du gènes de leffecteur à fixer. Non présentes pour tous les effecteurs à transloquer. maintiennent conformation (non active) de leffecteur, indispensable à la sécrétion. hélice amphiphile Fixation Protéine effectrice

40 La translocation Signal in vivo : contact Cellules / Bactérie Cellule cible Bactérie Contact Activation de la sécrétion de type III

41 Pseudomonas et Yersinia effecteurs inductibles (répression avant contact) Translocation directionnelle

42 Salmonella (SP-1) et Shigella effecteurs accumulés avant contact Translocation non directionnelle

43 Schlumberger et al, 2005 PNAS. = non invasive = SPI-1 TTSS -

44 Schlumberger et al, 2005 PNAS. Start 10-90sec End pool sec (6-/ molecules)

45 Contact = récepteurs in vivo ? Cellule cible Bactérie Activation de la sécrétion de type III Récepteurs Récepteurs bactériens et ligands cellulaires ? Récepteurs bactériens TTSS identifiés ex : Yersinia YopN Salmonella SipD Shigella IpaD Ligands cellulaires ex: Intégrine ( IpaA, IpaC, IpaD)

46 « Le translocateur » m B mp C. Bactéries contact Cellules Effecteurs transclocateur

47 « Le translocateur » Domaines hydrophobes ( ) formant spontanément des pores membranaires (hémolyse) Chaperonnes car lytiques pour bactéries (YopB / SycD) Bi-fonctionnelle effecteur/translocateur (IpaB, SipB) YopB YopD IpaB Yersinia Shigella

48 Les effecteurs de type III, sécrétion in vitro kDa EGTA/MgCl CHA CHA- ExsA ExsAC ExoS ExoT PopB PopD ExoS ExoT PopB PopD kDa EGTA/MgCl CHA- ExsA kDa EGTA/MgCl P. a CHA- ExsA ExsAC CHA- ExsA -+ CHA- ExsA ExsAC P. a ExsA -+ ExoS ExoT PopB PopD Induction sécrétion in vitro (mime le contact) : - Déplétion en Calcium (Pseudomonas, Yersinia (+37°C)) - Colorant Rouge Congo (Shigella, Salmonella) Pseudomonas aeruginosa Translocateur Effecteurs Dacheux et al, 1999 Infect. Immun.

49 Détermination de la taille du pore Osmoprotection Diamètre de 1,3 à 3 nm Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

50 Schoehn et al, 2003 EMBO Modèle PopB/PopD (P. aeruginosa)

51 PopB/PopD et liposome (MET) Schoehn et al, 2003 EMBO PopBPopB autre coloration PopD PopB/PopD PopB/PcrH

52 Les effecteurs de type III, sécrétion in vivo Appareils de sécrétion homologues entre espèces alors que effecteurs diversifiés spécifiques de lespèce (voir spécificité clonale) Tous ne sont pas des effecteurs toxiques (éléments de régulation, de translocation) Effecteurs toxiques devenant actifs dans le cytoplasme cellulaire agissant sur voies de signalisation. But: tuer (B. extracellulaire) ou entrer (B. intracellulaire) dans la cellule. Responsables des phénotypes infectieux spécifiques. (mutants TTSS moins virulents)

53 Protéines sécrétées par le TTSS (pathogènes danimaux)

54 Activités des effecteurs de type III Tyrosine Phosphatase (YopH) Kinase sérine/thréonine (YopO, StpP) Récepteur bactérien (Tir) GAP (YopH, StpP) Multiples ou unique ADP- ribosylation (ExoS, ExoT) Inconnues (YopJ, SipC, YopM…) Adénylate cyclase (ExoY) Lipase (ExoU)

55 Effets des effecteurs de type III Modification du cytosquelette dactine Cytosquelette Shigella Salmonella SipB SipA IpaA IpaB IpaC Rho, Rac cdc42 SopE « Ruffling » EPEC Tir EspB EspA « Piédestal » P. aeruginosa ExoT ExoS ExoYMorphologie arrondie arrondie Yersinia Inhibition phagocytose YopE YopT YopH YopO

56 Signalisation cellulaire et inflammation Yersinia YopE YopT YopH EPEC EspB SipB SipA Salmonella IpaA IpaB Shigella IpaC SopE Inflammation YopP/J Inhibition phagocytose MAPKinase Cytokine (TNF )Inflammation NF-kB Cytokine (TNF IL1, IL8)

57 Yersinia EPEC Tir EspB SipC Salmonella IpaA IpaB Shigella IpaD SopE YopM Trafic intracellulaire Phagosomes Lysosomes P. aeruginosa ExoY AMPc

58 condensation de la cellule formation de protubérences membranaires (budding), fragmentation ADN, formation de corps apoptotiques gonflement de la cellule et du noyau désintégration de la membrane plasmique absence de fragmentation de lADN ONCOSE (oncos, swelling) APOPTOSE NECROSE Inflammation Oncose / Apoptose Phagocytose par macrophages Mort cellulaire Majno et al., 1995 Am. J. Pathol.

59 Oncose / Apoptose Oncose Apoptoseprécose Apoptosetardive Temoin J774 Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

60 Mort cellulaire Yersinia YopE YopT P. aeruginosa ExoT ExoS SipB Salmonella IpaB Shigella YopP/J IpaC ExoU Caspase APOPTOSE Inflammation ONCOSE

61 Origine flagellaire de la sécrétion de type III Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev. Homologie avec les gènes codant l'appareil d'assemblage du flagelle. Yersinia : appareil flagellaire sécrète facteur de virulence (YplA). Evolution: B. Végétaux puis animaux transferts horizontaux (plasmides, PAI mobiles) entre bactéries. protéines de la mb externe homologues protéines appareil Type II TTSS Flagelle

62 Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas

63 Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas

64 Structure et fonction du TTSS conservées entre especes Mutant Shigella IpaA complémenté par SipB de Salmonella Frithz-lindsten et al, 1998 Mol. Micro. Transcomplémentations hétérologues : Mutant Yersinia YopBD complémenté par PopBD de Pseudomonas

65 Virulence du TTSS in vivo Exemple: infection à Salmonella thyphimurium Galan, 2001 An. Rev.Cell.Dev.Biol.

66 Phagocytes Activation de la sécrétion de type III (ExoS, ExoT, ExoU, ?) Médiateurs toxiques Adhésion Epithélium pulmonaire Bactérie Exemple supposé: infection pulmonaire à pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Répression de la sécrétion de type III Oncose

67 Système de sécrétion de type III, outils thérapeutiques ? Délivrer dans les cellules, par le TTSS dune bactérie atténuée, lépitope présenté par le CMH I pouvant activer les LT CD8+ spécifiques. Ces LT CD8+ pourront alors éliminer la future infection virale. Objectif : infection virale

68 Vaccination de souris contre virus LCMV avec S. thyphimurium injectant lépitope protecteur via TTSS. Rüssmann et al, 1998 Science Epitope protecteur Epitope non protecteur SipD- (TTSS-) Contrôle LCMV: Lymphocytic choriomeningitis virus

69 Evan et al, 2003, J. Virol. Activation de LTCD8+ spécifiques de linfection au SIV chez le Macaque rhésus par ingestion de Salmonella sécrétant lépitope

70

71 exoS,exoT,exoY exsA CHA CF1CF2CF3CF5CF6CF7CF8CF9 CF10CF11 CF12CF13 CF14CF15CF16CF17CF18CF19CF20 RIE REN7REN3T K569 REN4 CF4 REN0 7 kb Sécrétion % Cytotoxicité (J774) exoU Diversité clonale des effecteurs de type III parmi des souches infectieuses de P. aeruginosa Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity.

72 Inhibition phagocytose chez Yersinia sp

73 « Ruffling » Wolf-Dietrichet al, 1998 Cell Salmonella Shigella

74 « Piédestal » Hueck, 1998 Mico. Mol. Bol. Rev.

75 Morphologie arrondie « Round up, flat eggs » Dacheux et al, 2000 Infect. Immunity. J774 non infectés J774 infectés

76 Effet apoptotique des Yops de Yersinia sp

77 Dacheux et al, 2001 Mol. Mic.

78 Effets anti-inflammatoires des Yops de Yersinia sp


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