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Les gels dagarose et de polyacrylamide Applications à la biologie moléculaire.

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1 Les gels dagarose et de polyacrylamide Applications à la biologie moléculaire

2 Lagar-agar Agar-agar est un mot d'origine Malaise qui désigne en extrême-orient la gelée obtenue à partir de diverses algues rouges gélidium gracilaria Au XVIIème siècle par un cuisinier Japonais. Une industrie dont le Japon conserva seul la maîtrise jusqu'à la 2ème guerre mondiale. Une découverte accidentelle le gel d'agarose

3 De lagar-agar à lagarose 16 to 38 US$ /Kg Purified Agar 38 to 60 US$ /kg 535 to US$ /kg agarose Purification plus ou moins importante Caractéristiques principales: Forme un gel à 34-43°C après ébullition Ne se re-solubilise quà 85°C

4 L'agarose est un polymère d'un diholoside ( Da) C4 C3 C1 1,3- links are more easily hydrolysed by enzymes (Pseudomonas atlantica) 1,4- links are more easily hydrolysed by acid catalysts 1,4- links make the polysaccharide chain particularly compact and resistant to breakage, as is found in the peptidoglycan of bacteria.

5 Organisation en double hélice ZOOM -

6 Structure dun pore du gel Selon la concentration dagarose lempilement des pores est plus ou moins important Les espaces dans le gel sont plus ou moins petits Simulation de la taille des pores en fonction de la concentration du gel Concentration dagarose

7 Le gel dacrylamide C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation : acrylamidebis-acrylamide Pourqouoi ces 2 composés sont ils nécessaires à la polymérisation ?

8 2)La propagation de ce radical enclenche alors la polymérisation: M + I* -> M* M* + M ->M-M* M-M* + M -> M-M-M* … Notez la présence du double lien C-C à l'extrémité de la molécule. Quand un des carbones impliqués dans le double lien prend, sous l'influence d'un initiateur, une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer le double lien C-C d'une autre molécule 1) formation spontanée ou induite d'un radical au niveau l'initiateur: I -> I* M-M-M-[M]n-M* solution visqueuse impossible à manipuler

9 seul site de formation de radical par molécule 2 sites de formation de radical par molécule Bis-acrylamide ponte les chaînes d'acrylamide Formation dun gel Agent réticulant

10 Principaux agents réticulants le N,N'-méthylène bisacrylamide est l'agent réticulant le plus utilisé Le diacrylamide de piperazine gels un peu plus solides et résolution améliorée. D'autres agents réticulants peuvent être utilisés si on veut des gels "resolubilisables" gels plus fragiles Le BAC (N,N'-bisacrylylcystamine) a des liens disulfures qui peuvent être détruits par un réducteur de liens disulfures. Le DATD (N,N'-diallyltartradiamide) a des liens diole, donnant un gel solubilisable à l'acide périodique, !

11 Structure du gel dacrylamide/bis-acrylamide La quantité d'acrylamide Du rapport bisacrylamide/acrylamide Quantité dacrylamide et/ou bis acrylamide La porosité du gel Plus fine que le gel dagarose

12 Principes physiques de lélectrophorèse Applications des gels à lélectrophorèse Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres. Les molécules anioniques migrent vers l'anode et les molécules cationiques se déplacentanode vers la cathode.cathode La méthode de l'électrophorèse est basée sur le déplacement d'ions sous l'effet d'un champions électrique. Ce support peut être liquide : on parle alors d'électrophorèse en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937). Mais les principales applications utilisent un support poreux (gels) qui va stabiliser la phase liquide : on parle alors d'électrophorèse sur support ou d'électrophorèse de zones. Le champ électrique est obtenu par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par un tampon de pH et de concentration convenables dont les ions conduisent letamponpHions courant d'un pôle à un autre.

13 Lélectrophorèse des molécules dADN Eléments nécessaires: Un supportGel dagarose ou polyacrylamide Tampon délectrophorèse Marqueur de poids moléculaire Tampon de charge colorants Les acides nucléiques macromolécules polyanioniques uniformément chargées. (pH 7,5-8) De ce fait sous l'effet d'un champ électrique ils peuvent migrer sur un support solide, un gel et être séparés. La charge relative étant constante, le système de discrimination entre les molécules est : l'effet de filtration du gel utilisé « Tamisage moléculaire » leur masse moléculaire ou nombre de paires de bases pb

14 Le gel dagarose support le plus utilisé. Les tailles de fragments qu'il est possible de séparer sont comprises entre 0,5 et 20 kb. Les gels sont coulés à l'horizontale dans des appareils transparents aux UV de manière à pouvoir suivre périodiquement la migration. La migration est horizontale Vocabulaire: Cuve délectrophorèse Dépôt déchantillon dans les Puits du gel

15 La concentration dagarose ANODE CATHODE + - Migration Brin dADN de tailles différentes

16 ANODE CATHODE + - Migration Brin dADN de tailles différentes Faible concentration en agarose Meilleure séparation des brins de grandes tailles

17 ANODE CATHODE + - Migration Brin dADN de tailles différentes Forte concentration en agarose Meilleure séparation des brins de petites tailles

18 Correspondance tailles des brins dADN/ concentration dagarose % dagaroseÉventail de taille dADN (bp) 0,75 1 1,25 1,5 2 2,

19 Cas du gel de polyacrylamide Utilisé pour la séparation des fragments dADN de moins de 1000 pb à la base près. Le gel est coulé entre deux plaques de verre à l'abri de l'oxygène. La migration est verticale. Ses utilisations majeures : Purifier des oligonucléotides de synthèse et éliminer des nucléotides libres Déterminer des séquences d'ADN. Séparer des petits fragments d'ADN

20 Limportance du tampon délectrophorèse La mobilité électrophorétique Composition du tampon (pH 7,5-8) Résistance ionique du tampon En absence dions la conductance est nulleLADN ne migre pas Résistance ionique élevée Conductance élevéeMigration rapide Augmentation de la température Exemples: Tris Borate EDTA (TBE) Tris Acetate EDTA (TAE) Tris Phosphate EDTA (TPE)

21 Le tampon de charge Tampon de charge : bleu de bromophénol et/ou xylène cyanol - glycérol - tampon délectrophorèse. Les 2 colorants permettent de suivre la migration des fragments d'ADN : La migration du Xylène cyanol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 4000 pb La migration du bleu de bromophénol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 300 pb Xylène cyanol bleu de bromophénol Augmentation de la densité de léchantillon évite que lADN sorte du puit Ajout de couleur à l échantillon simplifiant le dépôt.

22 Le marqueur de poids moléculaire La distance de migration dun fragment dADN dépend de: Du temps La tension Du gel Des concentrations de tampon De la cuve utilisée De nombreux facteurs plus ou poins contrôlés Mauvaise reproductibilité Nécessité des marqueurs à chaque expérience tailles connues mêmes conditions de migrations que léchantillon Détermination des tailles des fragments dans léchantillon Indépendante des conditions expérimentales Indicateur de reproductibilité de lexpérience

23 La visualisation des brins dADN Le bromure d'éthidium se lie à l'ADN bicaténaire par intercalation. Le bromure déthidium

24 Le bromure d'éthidium est extrèmement dangereux mutagène/carcinogène et nécessite de porter des gants pour manipuler les gels lors de la révélation et après. Ils occupent un site interbase sur deux jusqu'à saturation. Ce type de liaison est dit "par exclusion du voisinage". B.E.T Les intercalants sont séparés les uns des autres par des intervalles de 10,2 Å. !

25 La comparaison visuelle de la fluorescence d'un échantillon avec celle d'une quantité d'ADN connue (le marqueur de taille) permet d'estimer la quantité d'acides nucléiques déposée. UV Le BET émet une fluorescence orange lorsqu'il est éclairé par des UV courts ( nm). Le seuil de détection est de quelques ng. La détermination de la taille d'un fragment se fait par rapport à la migration d'un marqueur approprié contenant des fragments de tailles connues. Utilisations:Dans le gel dagarose avant la migration Gel est placé dans un bain (10 min) après la migration OU

26 Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui ne nécessitent pas l'emploi d'UV ni de BET le bleu de méthylène l'azure A le bleu de toluidine Limite: moins sensibles La coloration au bleu de Nile semble une méthode à la fois sensible et non dangereusebleu de Nile La durée de coloration estimée à 15 h !!! Gels après coloration par le bleu de Nile Limite:

27 Application : détermination de la taille exacte de fragments dADN Réalisation de lexpérience

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30 Détermination des distances de migration

31 Tracé de la droite : log (taille) = f(distance de migration) Permet de déterminer la taille en paires de base d'un fragment d'ADN inconnu

32 Cas particulier des plasmides Autres applications et cas particuliers pGLO M 5371 pb Plasmide est circulaire différentes configurations influence sa migration La forme la plus abondante 4350 pb stucture superenroulée La forme la moins représentée 9416 pb structure circulaire, non superenroulée Plasmide non coupé

33 Toutes les formes dun plasmide non coupé Dun peu plus près… relaché 1 vrille 2 vrilles Encombrement diminue Vitesse augmente « Supercoil » Migration des plasmides non coupés ne dépend pas que de leurs taille mais aussi de leurs structures

34 Migration dun plasmide coupé (double coupure par topoisomérase II) Forme linéaire très majoritaire, relâché et supercoil minoritaires Autres formes enroulées en dessous su seuil de détection

35 Lélectrophorèse en champ pulsé (PGFE) Séparation des fragments de taille supérieure à 20 kb. Principe Changer l'orientation et/ou la polarité du champ électrique alternativement au cours du temps A chaque modification du champ, la molécule d'ADN doit se réorienter parallèlement au nouveau champ. Le temps nécessaire à la réorientation est proportionnel à la longueur de la molécule. Lorsque le champ est rétabli dans son sens initial, la molécule doit une nouvelle fois se réorienter Ces temps de réorientation provoquent un retardement de la migration nette qui est proportionnel à la taille de la molécule. Le support de migration est un gel d'agarose à 0,8 % et la taille des fragments séparés est de l'ordre de 50 kb à quelques mégabases.

36 Application de la PGFE Typage de souches bactériennes Utilisation denzymes de restriction reconnaissant des sites de coupure "rares", Générant un nombre restreint de fragments dADN de très grande taille. La difficulté de cette technique: Manipulation de molécules de grande taille quil faut éviter dendommager « empaquetage »

37 Pour récupérer l'échantillon : la bande est découpée et l'acide nucléique est obtenu Après diffusion dans un tampon adéquat. OU Par extraction par kit commercial. Electrophorèse préparative : Les principes et conditions techniques sont identiques à ceux de l'électrophorèse analytique Après migration, on repère les bandes correspondant à l'acide nucléique à purifier.


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