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SÉCRÉTION DES FACTEURS DE VIRULENCE CHEZ LES BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES SOPHIE BLEVES, ROMÉ VOULHOUX NAWEL ADJEROUD.

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1 SÉCRÉTION DES FACTEURS DE VIRULENCE CHEZ LES BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES SOPHIE BLEVES, ROMÉ VOULHOUX NAWEL ADJEROUD

2 Sécrétion Protéines Enzymes Toxines Excrétion Elimination de Déchets Survie et Adaptation

3 M. Externe Périplasme M. Interne Cytoplasme Extérieure Processus Complexe Nécessite six systèmes de sécrétion

4 Type VI

5

6 Vibrio cholerae Vibrio cholerae bactérie à gram négatif (bacille virgule en français) Forme: bâtonnet incurvé, mobile responsable du choléra chez lhomme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).

7 Sécrétion membranaire de toxine AB 5 S/unité A S/unité B 5 Système de sécrétion type 2

8 Type II secretion system of V. cholerae:. ATPase: EpsE. Plateforme MI: EpsE, L, F, M. EpsD Petidase EpsO Pseudopilins Pseudopilus (assemblageG) Sécrétion Exportation

9 TYPE IITYPE IV Homologie T2SS-T4SS Pseudopilus Pilus Pseudopilins Pilins

10 Bibliographie: Rôle de EpsG Apparition Pseudopilus à la surface eps GAll eps genes Proteines Platforme MI ATPase: EpsE eps Operon [EpsG] Surexpression G Constants

11 Comment? EpsG---EpsE GGG The Question is EpsL Lien possible Lien Direct/Indirect ???

12 Pourquoi L: Linker ? Bibliographie: Mutation en E supprime mutation en G Etude structurale E: a un site dinteraction avec L: E interagit avec G via L E L G Lien E-G ? G-L

13 Méthodologie Pour déterminer interaction EpsG-EpsL: 1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking 2- Co-immunprécipitation

14 1. Pontage chimique (DSP) Molécules en interaction « faible » (difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...), Ou simplement à proximité lune de lautre Pontage covalent entre les 2 molécules Agents de pontage DSP, imidoester bifonctionnel, glutaraldéhyde, formaldéhyde. Figer / immobiliser ces molécules

15 Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires. DSP+Pro1 Liaisons amides covalentes DSP-Pro1 Libération NH-ester DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product +Pro2 Pro1-DSP-Pro2 Libération NH-ester Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de Lomant Réaction avec amine primaire

16 DSP EpsG EpsL 1 2

17 2. Co-immunoprécipitation Technique didentification des interactions protéine-protéine: Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!

18 EpsG EpsL SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la biotine

19 RESULTATS

20 Sans EpsG ou L Absence G-L: Il existe bien interaction EpsL -- EpsG 60kDa 35kDa Dimère EpsG 15Kda Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG

21 Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu Mutations epsL et epsG pas de sécrétion de protéase: complexe G-L nécessaire sécrétion Contrôle: Mesure activité Protéase

22 Confirmation Délétion depsG ou epsL Absence du complexe EpsL-EpsG Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG

23 Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG Lanes 4, 6 Augmentation EpsG et complexe G-L Lanes 7, 9 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

24 2. Immunoblott pour EpsG

25 3. Immunoblott pour EpsL Lanes 7, 9 Augmentation EpsL et complexe G-L Lanes 4, 6 Apparition EpsG-EpsL ??? Confirmation L est lié à G 60kDa=EpsG-EpsL

26 4. Immunoblott pour EpsL

27 1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG Mutation pilD Pas de complexe G-L EpsG non clivée de PM élevé Clivage PilD Nécessaire au G-L

28 2-Clivage par PilD: sur Mutant G Clivage EpsG par PilD est nécessaire au cross-link avec EpsL Dans pEpsG G-1V Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion

29 Lien direct/indirect 1. Rôle des autres membres T2S….??? Seule EpsL est essentielle à la formation G-L EpsL EpsG Interagissent Directement

30 2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour G E. coli G-L formé En présence de EpsG EpsL Aucune protéine de V.cholerae est impliquée G se lie de préférence à L qd L est présent

31 3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….??? Immunoblott pour L Association EpsG-EpsL spécifique

32 Liaisons H Asp91-Thr112 Effet Mutation T112, D91 de EpsG…??? G devient moins stable

33 Substitutions T112 D91de EpsG WT mutantG+Plasmides : Immunoblott pour EpsG Absence G-L si résidus G substitués (D91E, T112L) Pas de Sécrétion si Résidus substitués: domaines conservés Chez ts homologues

34 Conclusion

35 Etude interactions EpsG-EpsL cross-link (1pseudopilin Majeur- le reste duT2SS) Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins Interactions EpsE-EpsL Apport de larticle…? EpsL: Scaffold transduction de signaux entre E-G Linker de lATPase:EpsE- EpsG: conversion énergie EpsG clivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL. Lassociation EpsL- EpsG est spécifique: sans aucun autre composé T2SS. Lhydrolyse ATP: Changement dynamique de E Qui affecte L Qui permet assemblage de G

36 Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP) ATP ADP +Pi OM IM EpsD EpsE EpsF Eps L M C Peptidase PilD T T T G G G G G Clivage PilD G G G G Pseudopilins Sec The conversion of chemical energy to mechanical work: Polymérisation des G Sécrétion G G Pseudopilus filaments en Hélice T Exportation de toxine

37 Sécrétion de toxine chez V. cholerae Piston

38

39 Futures Etudes.…? Déterminer le site précis dinteractions entre EpsG et EpsL. Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils recrutés eux aussi par EpsL par hydrolyse dATP? Pour être incorporer dans le pseudopilus. Comprendre réelement limplication des interactions EpsG-EpsL (hydrolyse dATP et ???)

40 Des questions ???.... Des commentaires ???.... De votre attention


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