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Un pathogène dactualité Clostridium difficile Dr Levent: Équipe opérationnelle en hygiène - référent en antibiothérapie. CHSA Manica Vasseur: Laboratoire.

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1 Un pathogène dactualité Clostridium difficile Dr Levent: Équipe opérationnelle en hygiène - référent en antibiothérapie. CHSA Manica Vasseur: Laboratoire de biologie. CHSA Maubeuge FMC 09/11/2006

2 2. Diagnostic Bactériologique Manica Vasseur – Biologiste Laboratoire. CHSA La bactérie : caractéristiques et facteurs de virulence Le diagnostic bactériologique État des résistances

3 2. Caractéristiques de la bactérie Bacille Gram Positif anaérobie strict Spore subterminale peu déformante Souches: toxinogènes (pathogènes) non toxinogènes (non pathogènes) Toxine A:entérotoxine Toxine B: cytotoxine

4 2. Caractéristiques de la bactérie La Toxine A induit: une inflammation importante Une infiltration massive de la muqueuse intestinale par des polynucléaires et des cellules mononuclées Une nécrose de lépithélium intestinal Une accumulation de fluide dans lépithélium intestinal

5 2. Caractéristiques de la bactérie La Toxine B : 1000 fois plus puissante/toxine A. Elle est cytotoxique induit un effet cytopathogène (rétraction cellulaire, dépolimérisation des filaments dactine du cytosquelette Induit une augmentation de la perméabilité de la muqeuse intestinale

6 2. Caractéristiques de la bactérie Les toxines A et B agissent en synergie Distinction classique Toxine A/Toxine B nest pas aussi tranchée. Les 2 toxines sont dotées de propriétés cytotoxiques et entérotoxiques (Savidge et coll 2003) Polypeptides de grandes tailles (308 et 270 Kda) présentant toutes 2 des structures primaires similaires Joueraient un rôle dans ladhérence bactérienne (Tasfeyne et coll-2001, Borriello et coll-1998) Domaine transmembranaire intervenant dans la translocation des toxines dans le cytosol Domaine N terminal Activité enzymatique toxique Site de liaison aux cellules cibles

7 Mécanisme d'action des toxines Liaison aux récepteurs des entérocytes Production de cytokines proinflammatoires par les monocytes (TNF IL1,et 6) et les entérocytes (MIP 2, IL8 ) Internalisation Inactivation des proteines Rho Désorganisation du cytosquelette cellulaire Augmentation de la perméabilité paracellulaire Diarrhée aqueuse Action directe Actions indirectes Infiltration massive de polynucléaires activés Nécrose des cellules coliques Inflammation sévére Destruction des cryptes intestinales Lésions épithéliales Pseudomembranes : PN, fibrine, débris cellulaires Induction de L'apoptose de certaines cellules intestinales

8 2. Caractéristiques de la bactérie Autres facteurs de virulence: Facteurs dadhésion Structures spécifiques favorisant la persistance de la bactérie dans le tube digestif continuellement lavé par les fluides intestinaux Structures dadhésion au mucus: flagelles ou Fumbriae Structures dadhésion aux cellules hôtes: prteines de la couche S, Adhésine Cwp66, Proteine Fbp68

9 2. Caractéristiques de la bactérie Autres facteurs de virulence: Enzymzes hydrolytiques (gélatinases, hyaluronidases…) facilitent le maintien de la bactérie dans le tube digestif Les souches les plus virulentes sont les plus protéolytiques dans les modèles animaux.

10 Autres facteurs de virulence Sécrétion d'autres toxines Toxine binaire ( ADP ribosyl- transférase spécifique de l'actine ) Dépolymérisation de l'actine Ballonisation des cellules Aurait un rôle dans la virulence de souches particuliéres

11 2. Réponse immunitaire de lhôte La production danticorps (IgG anti-toxine A notamment) serait protectrice Une bonne réponse humorale pourrait assurer une bonne protection contre les récidives (Kyne et coll- Lancet 2001)

12 Facteurs de virulence et réponse immunitaire Le degré de virulence de chaque souche et les différents niveaux de réponse de l'hôte pourraient expliquer les présentations cliniques très variées observées

13 Le diagnostic biologique : Principes dutilisation des tests Respect des indications : Patients diarrhéiques Facteurs de risque : antibiothérapie < 4 s ( la durée de l'antibiothérapie majore le risque ) ou hospitalisation récente, chimiothérapie, laxatifs, stimulants gastro- intestinaux, tous les facteurs modifiant l'écosystéme ou la motilité intestinale ) Test non effectué sur selles solides sur écouvillon Quantité de selles suffisante (au minimum 3 ml ) Généralement un seul prélévement suffit Inutiles chez les patients asymptomatiques Test de contrôle pendant ou après le traitement non recommandé Un test positif sans diarrhée ne nécessite pas de traitement (portage sain)

14 Taux disolement de Clostridium difficile

15 Diarrhées post antibiotiques : d'autres responsables ? Staphylococcus aureus Candida Clostridium perfringens Klebsiella Oxytoca

16 Mise en évidence des toxines Mise en évidence de Clostridium Difficile Isolement Dépistage de l'antigéne Ag GDH ElisaC ytotoxicité PCR 4. Le diagnostic biologique Selles

17 Mise en évidence des toxines dans les selles - Recherche de l'Effet cytopathogéne - Recherche des toxines - Recherche par PCR

18 La technique de référence :Culture cellulaire Sensibilité 80-90% Spécificité 100% Infrastructure lourde requise Recherche d' un effet cytopathogène de la toxine B Après dépôt dun filtrat de selles sur les cellules LECP correspond à une ballonisation des cellules

19 Recherche de toxines T est Elisa ou immunochromatographiques utilisant des anticorps monoclonaux dépistant -la toxine A -ou les toxines A et B En France : 1 à 3% des souches sont Toxine A- B+ Technique rapide : environ 30 minutes Limites des tests : Spécificité > 97% Sensibilité : % ( pg de toxines) Faux négatifs

20 Techniques de biologie moléculaire La PCR : Amplification génétique Sensibilité (91 à 97%) Spécificité : 100% Nécessitant un équipement particulier :non réalisable dans les laboratoires classiques Problème de fiabilité : présence dinhibiteurs de la réaction dans les prélèvements Techniques de PCR en temps réel : Plus rapides et plus fiables Réalisable dans tous les laboratoires En développement Problème de côut

21 Mise en culture Ensemencement d'une suspension de la selles sur un milieu contenant: des inhibiteurs: Cyclosérine Céfoxitine du Taurocholate : permettant la germination de spores ( augmente la sensibilité de la culture ) Incubation en anaérobiose stricte h à 37°C

22 Aspect en culture Colonies circulaires à bords irréguliers (3-5 mm), non hémolytiques - présentant un aspect de verre fritté - odeur caractéristique de crottin de cheval - colonies fluorescentes sous UV

23 Identification Equipement enzymatique : Rapid 32A ( bioMérieux ) Inoculum lourd (4 - 5 McF )

24 Importance de la culture Manque de sensibilité des tests de recherche de toxine 10 % des infections à Clostridium Difficile ne seraient dépistées que par la culture

25 Méthodes génotypiques : PCR-ribotypage Toxinotypie Typage des souches recues au CHSA R echerche de toxinogénicité de la souche isolée

26 Méthodes génotypiques : PCR-ribotypage Toxinotypie Marqueurs de différenciation des souches isolées En période épidémique Démonstrer l'existence de contamination croisée entre patients hospitalisés Analyse des souches en circulation Suivi de l'émergence de nouveau variants Différencier une rechute d'une réinfection en cas d'isolement répété d'un Clostridium Difficile chez un même patient Typage des souches

27 4. La sensibilité aux antibiotiques En pratique courante, les études de sensibilité sont rarement effectuées En effet: les traitements habituels sont toujours efficaces (pour linstant) ATBgramme standard (par diffusion en gélose) mal adapté aux anaérobies stricts

28 Antibiotiques incriminés Fréquemment : Clindamycine, Lincomycine, Amoxicilline, Augmentin Céphalosporines, Bactrim Moins souvent: Macrolides, Phénicolés, Quinolones, Cotrimoxazole, Rifampicine,Tétracyclines Jamais Aminosides

29 Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (2) Céphalosporines Céfoxitine Moxalactam Fluoroquinolones Résistance naturelle Amoxicilline Pipéracilline Imipénème Glycopeptides Imidazolés Erythromycine Tétracycline Rifampicine Chloramphénicol Habituellement sensible

30 Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (3) 3 souches Vanco-R (Dworczynski 1991) 3%Souches toxinogénes Vanco-I (Pelaez % (49/469) de souches R (Pelaez 1998) 6%Souches toxinogénes metro cmi > 32 ( 415 isolats )(Pelaez 2000) 3% de souches non toxinogénes I (Barbut 1999) V ancomycine Métronidazole Vancomycine: 0,25-4 mg/l Métronidazole: 0,25-1 mg/l CMI La vancomycine et le métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites

31 Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (1) Rares études disponibles sur la fréquence des résistances 23,7 64, ,5 11,6 - 7, ,5 22,7 9,7 - Tetracyclines Erythromycine Rifampicine Chloramphénicol Barbut 1999Niyogi 1992Levett 1988Delmée 1988 % de résistance de C.difficile aux ATB

32 Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (4) Chromosomique transférable (altération du ribosome) Chromosomique transférable (modification du ribosome) Inactivation enzymatique Macrolides Tétracyclines Chloramphénicol Mécanismes de résistanceAntibiotiques Mécanismes et supports génétiques des résistances

33 Sensibilité de C.difficile aux quinolones Ofloxacine, Ciprofloxacine: CMI 8 à 16 mg/l Levofloxacine : CMI 4 à 8 mg/L Moxifloxacine : cmi plus basses : 0,5 à 2 mg/l Résistance à la moxifloxacine 12% : étude Allemande ( )

34 Sensibilité de C.difficile au linézolide Cmi des souches sensibles : 0,03 à 4 mg/l Des souches résistantes ont été décrites : Ackerlman et Coll en 2003 : 23 souches de sensibilité diminuée sur 192 isolats Résistance associée aux fluoroquinolones et macrolides


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