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Thèse effectuée sous la direction dHervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP) MODIFICATIONS.

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1 Thèse effectuée sous la direction dHervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP) MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Marina Casselyn

2 2 MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV

3 PRESENTATION DU VIRUS Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV I

4 4 Le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) est particulier aux graminées. Le BMV est produit au laboratoire par inoculation de plants dorge. Le rendement est de 100 mg de virus pour 100 g de feuilles infectées. 100 nm coloration négative I

5 5 capside « sphérique » de 270 Å de diamètre le virus n est pas enveloppé le centre du virus est creux génome à ARN simple brin tripartite (enzymes de réplication, protéine de capside, protéine de mouvement) masse de 4,6 MDa coque protéique lumen ARN 270 Å Caractéristiques du BMV I

6 6 protéines de mouvement désassemblage co-traductionnel pH < 7 pH > 7 protéines de capside ARN polymérases Prolifération virale I

7 7 (daprès Speir et coll., 1995) La capside résulte de l auto- assemblage de 180 protéines identiques selon une symétrie icosaèdrique. A, B et C constituent lunité asymétrique de la capside. Le virus a un nombre de triangulation T=3. Les protéines A, B et C ont des séquences identiques, mais des structures quasi- équivalentes. Symétrie de la capside A B CA B C I

8 8 structure atomique du BMV (réf. PDB 1js9 – Lucas et coll; 2002) Structure atomique du BMV capsomères (hexamères et pentamères) I structure du CCMV (70% didentité de séquence avec le BMV) modélisation par homologie de séquences remplacement moléculaire

9 9 A C B A B C-ter Stabilisation de la capside interpénétration entre dimères fixation dions divalents à la surface I

10 10 Stabilisation de la capside les 6 protéines B et C forment un tonneau lARN tapisse lintérieur de la capside I

11 MODELISATION PAR CRYOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE DES FORMES COMPACTE ET GONFLEE DU BMV A 30 Å DE RESOLUTION Collaborations : Nicolas Boisset (LMCP) Célia Plisson (ICM) Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV II

12 12 Cryomicroscopie électronique La vitrification à -180°C permet lobservation des macromolécules dans leur état natif une plus grande résistance des échantillons aux radiations Reconstruction 3D (effectuée par C. Plisson, ICM ) observation de l ARN viral, dont l organisation ne peut pas être déterminée par diffraction des rayons X étude de la structure du BMV à l état gonflé, car les particules virales ont des diamètres hétérogènes à pH 7,5 ce qui empêche la cristallisation II TECHNIQUES

13 13 forme compacte pH 5,9 forme gonflée pH 7,5 Diamètre des particules virales à pH 5,9 : 280 Å à pH 7,5 : 304 Å II Microscopie

14 Å 304 Å à pH 7,5 : à pH 5,9 : existence de pores au niveau des axes 5 et des pseudo axes 6. - déplacement des capsomères Gonflement de la capside - apparition de pores au niveau des pseudo axes 3 II Reconstruction 3D

15 15 Réorganisation de lARN lARN se plaque contre la paroi interne, et obstrue les axes Å 160 Å ARN II

16 16 (Speir et coll., 1995) 1- LARN serait libéré à travers des pores qui se forment lors du gonflement du virus, au niveau des pseudo axes 3 (Albert et coll., 1997) 2- Même si lon empêche le gonflement de la capside, le virus prolifère. LARN serait libéré à travers les axes 5 icosaèdriques. 2 théories pour la libération de l ARN : II

17 17 Suite à laugmentation du pH, l ARN se positionne au niveau des axes 5 icosaèdriques. La sortie de l ARN se ferait au niveau des pentamères, ce qui va dans le sens de lhypothèse dAlbert et coll. CONCLUSION II

18 INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Collaborations : A. Tardieu (LMCP) J. Perez, P. Vachette (LURE) J. Witz (IBMC) Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV III

19 19 caractériser les interactions en solution d un nouveau modèle de macromolécule sphérique en fonction de différents paramètres physico- chimiques établir les relations entre interactions et conditions de cristallisation Objectifs des études III

20 I(c,s) s(A ) Diffusion des Rayons X aux Petits Angles Lintensité diffusée I(c,s) par une solution de concentration c, en fonction du vecteur de diffusion s=2 sin /, donne des indications sur: - la nature des interactions entre particules en solution - la forme et la taille des particules III

21 21 Interactions intermoléculaires en solution les forces répulsives de volume exclu les forces de van der Waals les forces coulombiennes les forces attractives de déplétion, en présence de polymères III

22 22 Modification de la charge des virus : variation du pH de 4 à 7,5 ajout d anions. Les ions nécrantent pas seulement les charges mais ont un effet différentiel sur les interactions en solution, leffet Hofmeister SO 4 2-

23 23 1 S(c,s) s (Å -1 ) 1 S(c,s) s (Å -1 ) attraction répulsion I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) facteur de forme signal diffusé par une particule unique facteur de structure caractérise la répartition des particules en solution Par extrapolation du facteur de structure à lorigine, S(c,0), en fonction de la concentration, on accède au second coefficient du viriel A 2 (mol.ml.g -2 ) A 2 > 0 A 2 < 0 1/S(c,0)=1+2MA 2 c Quantification des interactions I(0,s) s (Å -1 ) I(0,s) s (Å -1 ) /cRT=1+A 2 Mc+A 3 Mc 2 +… III

24 24 Effets de la variation du pH Laugmentation du pH provoque une diminution des interactions répulsives. La valeur du second coefficient du viriel A 2 passe de à mol.ml.g -2. La variation du pH provoque un changement de structure du virus III

25 25 modèles courbes exp. Conséquence de laugmentation du pH : Modèles de sphères creuses la diminution du rayon interne du virus, correspondant à une réorganisation de lARN III

26 26 Effets des sels Le NaNO 3 est plus efficace que lAcNa pour diminuer les interactions répulsives : effet Hofmeister III

27 27 La présence de sels provoque également une réorganisation de lARN La valeur de A 2 passe de à (mol.ml.g -2 ) Effets du NaN0 3 (pH 4) III

28 28 Conclusions sur les effets du pH et des sels La variation du pH et lajout de sels en solution provoquent une réorganisation structurale du BMV La variation de ces deux paramètres ninduit pas dinteractions attractives pouvant amener à la cristallisation du BMV III

29 29 Effets du polyéthylène glycol (PEG) (-CH 2 OCH 2 -) n L addition de PEG induit une attraction entre molécules. Il sagit dune « attraction de déplétion ». R g PEG 3000 : 23 Å R g PEG 8000 : 40 Å R g PEG : 70 Å RgRg 2R g 270 Å III

30 30 - leffet du PEG est relié à sa concentration % 6% 8% 10% I(c,s) s(A ) BMV 40mg/ml PEG leffet du PEG est relié à sa taille Effets du PEG sur le BMV en solution mg/ml BMV 10mg/ml BMV 20mg/ml BMV 40mg/ml BMV I(c,s) s(A-1) PEG % pics de diffraction III - les précipités sont microcristallins

31 CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN PRESENCE DE PEG Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV IV

32 PEG: diagrammes de phase et cristallisation IV

33 %2%4%6%8%10%12% BMV concentration (mg/ml) % PEG 8000 (w/v) Diagrammes de phase courbe de précipitation courbe de solubilité IV les conditions de précipitation permettent de prédire les conditions de cristallisation

34 34 10 % PEG 8000, pH µm Diffusion de vapeur Microbatch Cristallisation du BMV 4 % PEG 8000, pH 4 8 % PEG 8000, pH 4 (coll. C. Mayer, LMCP) les cristaux sont obtenus de façon reproductible, en présence de PEG seul IV

35 Cinétique dapparition et de croissance des microcristaux Collaboration : S. Finet (ESRF) IV

36 36 Ligne ID2 à l ESRF détecteur 2D échantillon I(s) s= 2sin =1Å stopped-flow RX - le « stopped-flow » permet le mélange rapide de l échantillon - la première mesure est effectuée 180 ms après le mélange - chaque mesure dure 50 ms - le faisceau est coupé entre 2 mesures consécutives IV

37 37 Conditions étudiées PEG PEG 3000 PEG ,5 à 20mg/ml de virus 2,5 à 10% de PEG IV

38 38 Signaux caractéristiques des échantillons échantillon précipité microcristallin échantillon non précipité IV

39 39 I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) division par le facteur de forme phase liquide phase solide Obtention du facteur de structure IV

40 40 (h 2 +k 2 +l 2 ) Indexation des pics de diffraction Lespacement des pics de diffraction est compatible avec une maille cubique face centrée a=b=c=390 Å 4 virus dans la maille IV

41 41 Caractérisation des pics de diffraction largeur des pics la croissance des pics est due principalement à la formation de nouveaux microcristaux la croissance des pics est due principalement à la croissance des microcristaux existants temps t=0 t>0 t=0 t>0 nombre de microcristaux N nombre de virus dans les microcristaux n 2 hauteur des pics 1/taille des microcristaux IV

42 42 largeur du pic concentration « 3ème pic » PEG %, BMV 20 mg/ml 800Å 1800 Å temps IV

43 43 Il nexiste que deux espèces en solution : le virus soluble, et le virus cristallisé. Les plus petits microcristaux ont un diamètre de 800 Å (de lordre de 20 particules virales) Premières conclusions IV les noyaux de nucléation ont une structure cristalline, et un diamètre denviron 800 Å

44 44 Les pics apparaissent plus nombreux et mieux différenciés avec le PEG qu avec le PEG PEG %, BMV 10 mg/ml PEG %, BMV 10 mg/ml On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline IV

45 45 Croissance des pics en fonction de la concentration en virus La hauteur des pics est reliée à la concentration initiale en virus et au nombre de microcristaux. IV

46 46 Conclusions Lapparition des microcristaux est directement reliée à: - la taille et la concentration du PEG - la concentration en virus La croissance des pics est principalement due à la formation de nouveaux microcristaux Lapparition puis la croissance des pics de diffraction s effectue au cours des premières secondes après le mélange IV

47 CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

48 48 LARN se plaque contre la paroi interne du virus lors du gonflement de la capside La cristallisation du BMV a lieu dans des conditions attractives, qui peuvent être prédites Les noyaux de nucléation des macromolécules sphériques auraient une structure cristalline. Déterminer la forme, sphérique ou plane, des noyaux de nucléation - AFM - cryodécapage Déterminer la structure du BMV à partir des cristaux obtenus en présence de PEG

49 49

50 50 TF banque de transformées de Fourier polaires sélection des particules virales « 2D » sélection des particules correctement orientées par rapport à la banque de TFP TF -1 Modèle de départ : virus de lhépatite B (Conway et coll., 1997) projections 2D TF -1 sélection des particules correctement orientées par rapport au nouveau modèle TF -1 TFP conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r, ) détermination de lorigine et de lorientation des particules sélectionnées Technique de la Transformée de Fourier Polaire (TFP) Baker et Cheng,1996 TF sélection des particules virales « 2D » conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r, ) détermination de lorigine et de lorientation des particules sélectionnées


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