MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Marina Casselyn Thèse effectuée sous la.

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1 MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Marina Casselyn Thèse effectuée sous la direction d’Hervé Delacroix Equipe de BioInformatique Structurale (CGM - UPMC) Collaboration : Annette Tardieu (LMCP)

2 MODIFICATIONS STRUCTURALES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DU BROME ET INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV

3 PRESENTATION DU VIRUS I Présentation du virus
Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV PRESENTATION DU VIRUS I

4 Le Virus de la Mosaïque du Brome (BMV) est particulier aux graminées.
100 nm coloration négative Le BMV est produit au laboratoire par inoculation de plants d’orge. Le rendement est de 100 mg de virus pour 100 g de feuilles infectées. I

5 Caractéristiques du BMV
coque protéique lumen ARN 270 Å • capside « sphérique » de 270 Å de diamètre • le virus n ’est pas enveloppé • le centre du virus est creux • génome à ARN simple brin tripartite (enzymes de réplication, protéine de capside, protéine de mouvement) • masse de 4,6 MDa I

6 protéines de mouvement
Prolifération virale désassemblage co-traductionnel protéines de capside ARN polymérases protéines de mouvement pH < 7 pH > 7 I

7 Symétrie de la capside I
La capside résulte de l ’auto-assemblage de 180 protéines identiques selon une symétrie icosaèdrique. (d’après Speir et coll., 1995) A B C Les protéines A, B et C ont des séquences identiques, mais des structures quasi-équivalentes. A, B et C constituent l’unité asymétrique de la capside. Le virus a un nombre de triangulation T=3. I

8 Structure atomique du BMV
structure du CCMV (70% d’identité de séquence avec le BMV) modélisation par homologie de séquences structure atomique du BMV (réf. PDB 1js9 – Lucas et coll; 2002) remplacement moléculaire capsomères (hexamères et pentamères) I

9 Stabilisation de la capside
interpénétration entre dimères fixation d’ions divalents à la surface A B C-ter I

10 Stabilisation de la capside I l’ARN tapisse l’intérieur de la capside
les 6 protéines B et C forment un tonneau  I

11 Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV MODELISATION PAR CRYOMICROSCOPIE ELECTRONIQUE DES FORMES COMPACTE ET GONFLEE DU BMV A 30 Å DE RESOLUTION Collaborations : Nicolas Boisset (LMCP) Célia Plisson (ICM) II

12 TECHNIQUES Cryomicroscopie électronique La vitrification à -180°C permet l’observation des macromolécules dans leur état natif une plus grande résistance des échantillons aux radiations Reconstruction 3D (effectuée par C. Plisson, ICM) observation de l ’ARN viral, dont l ’organisation ne peut pas être déterminée par diffraction des rayons X étude de la structure du BMV à l ’état gonflé, car les particules virales ont des diamètres hétérogènes à pH 7,5 ce qui empêche la cristallisation II

13 Microscopie II forme compacte forme gonflée pH 5,9 pH 7,5
Diamètre des particules virales à pH 5,9 : 280 Å à pH 7,5 : 304 Å II

14 Reconstruction 3D Gonflement de la capside II
270 Å à pH 5,9 : existence de pores au niveau des axes 5 et des pseudo axes 6. 304 Å à pH 7,5 : - déplacement des capsomères - apparition de pores au niveau des pseudo axes 3 II

15 Réorganisation de l’ARN
120 Å 160 Å l’ARN se plaque contre la paroi interne, et obstrue les axes 5. II

16 2 théories pour la libération de l ’ARN :
(Albert et coll., 1997) 2- Même si l’on empêche le gonflement de la capside, le virus prolifère. L’ARN serait libéré à travers les axes 5 icosaèdriques. (Speir et coll., 1995) 1- L’ARN serait libéré à travers des pores qui se forment lors du gonflement du virus, au niveau des pseudo axes 3 II

17 CONCLUSION Suite à l’augmentation du pH, l ’ARN se positionne au niveau des axes 5 icosaèdriques. La sortie de l ’ARN se ferait au niveau des pentamères, ce qui va dans le sens de l’hypothèse d’Albert et coll. II

18 INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION
Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV INTERACTIONS ENTRE PARTICULES VIRALES EN SOLUTION Collaborations : A. Tardieu (LMCP) J. Perez, P. Vachette (LURE) J. Witz (IBMC) III

19 Objectifs des études  caractériser les interactions en solution d ’un nouveau modèle de macromolécule sphérique en fonction de différents paramètres physico-chimiques établir les relations entre interactions et conditions de cristallisation  III

20 Diffusion des Rayons X aux Petits Angles
L’intensité diffusée I(c,s) par une solution de concentration c, en fonction du vecteur de diffusion s=2 sin /  , donne des indications sur: - la forme et la taille des particules - la nature des interactions entre particules en solution 1 10 2 3 4 0.005 0.01 0.015 0.02 I(c,s) s(A -1 ) III

21 Interactions intermoléculaires en solution
les forces répulsives de volume exclu les forces de van der Waals les forces coulombiennes les forces attractives de déplétion, en présence de polymères III

22 Induction d ’un régime attractif
 Modification de la charge des virus : • variation du pH de 4 à 7,5 • ajout d ’anions. Les ions n’écrantent pas seulement les charges mais ont un effet différentiel sur les interactions en solution, l’effet Hofmeister SO42-<HPO42- < CH3CO2- ~C6H5O73- < HCO3-< Cl- < Br- < NO3-< ClO4-< SCN-  Induction d’interactions attractives de déplétion par ajout de polyéthylène glycol III

23 Quantification des interactions
I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) facteur de structure caractérise la répartition des particules en solution facteur de forme signal diffusé par une particule unique I(0,s) s (Å-1) 1 S(c,s) s (Å-1) Par extrapolation du facteur de structure à l’origine, S(c,0), en fonction de la concentration, on accède au second coefficient du viriel A2 (mol.ml.g-2) attraction A2 < 0 I(0,s) s (Å-1) 1 S(c,s) s (Å-1) A2 > 0 répulsion 1/S(c,0)=1+2MA2c /cRT=1+A2Mc+A3Mc2+… III

24 Effets de la variation du pH
L’augmentation du pH provoque une diminution des interactions répulsives. La valeur du second coefficient du viriel A2 passe de à mol.ml.g-2. La variation du pH provoque un changement de structure du virus III

25 Modèles de sphères creuses
courbes exp. Conséquence de l’augmentation du pH : la diminution du rayon interne du virus, correspondant à une réorganisation de l’ARN III

26 Effets des sels Le NaNO3 est plus efficace que l’AcNa pour diminuer les interactions répulsives : effet Hofmeister III

27 Effets du NaN03 (pH 4) La valeur de A2 passe de à (mol.ml.g-2) La présence de sels provoque également une réorganisation de l’ARN III

28 Conclusions sur les effets du pH et des sels
La variation du pH et l’ajout de sels en solution provoquent une réorganisation structurale du BMV La variation de ces deux paramètres n’induit pas d’interactions attractives pouvant amener à la cristallisation du BMV  III

29 Effets du polyéthylène glycol (PEG)
(-CH2OCH2-)n Rg 2Rg 270 Å Rg PEG : 23 Å Rg PEG : 40 Å Rg PEG : 70 Å III L’ addition de PEG induit une attraction entre molécules. Il s’agit d’une « attraction de déplétion ».

30 Effets du PEG sur le BMV en solution
4 10 3 8 10 1.2 10 4 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 4% 6% 8% 10% I(c,s) s(A -1 ) BMV 40mg/ml PEG 8000 5 10 3 1 10 4 1.5 10 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 5mg/ml BMV 10mg/ml BMV 20mg/ml BMV 40mg/ml BMV I(c,s) s(A-1) PEG % pics de diffraction - l’effet du PEG est relié à sa concentration - l’effet du PEG est relié à sa taille - les précipités sont microcristallins III

31 CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN PRESENCE DE PEG
Présentation du virus Modélisation par cryomicroscopie électronique Interactions entre particules virales en solution Cristallisation et cinétique de nucléation du BMV CRISTALLISATION ET CINETIQUE DE NUCLEATION DU BMV EN PRESENCE DE PEG IV

32 PEG: diagrammes de phase et cristallisation
IV

33 Diagrammes de phase 10 20 30 40 50 60 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% BMV concentration (mg/ml) % PEG 8000 (w/v) courbe de solubilité courbe de précipitation les conditions de précipitation permettent de prédire les conditions de cristallisation IV

34 Cristallisation du BMV
Microbatch les cristaux sont obtenus de façon reproductible, en présence de PEG seul Diffusion de vapeur 4 % PEG 8000 , pH 4 10 % PEG 8000, pH 4 200 µm 8 % PEG 8000, pH 4 (coll. C. Mayer, LMCP) IV

35 Cinétique d’apparition et de croissance des microcristaux
Collaboration : S. Finet (ESRF) IV

36 Ligne ID2 à l ’ESRF IV l =1Å RX
I(s) s= 2sinq/ l 2q RX échantillon détecteur 2D - le « stopped-flow » permet le mélange rapide de l ’échantillon - la première mesure est effectuée 180 ms après le mélange - chaque mesure dure 50 ms - le faisceau est coupé entre 2 mesures consécutives stopped-flow IV

37 Conditions étudiées IV 2,5 à 20mg/ml de virus 2,5 à 10% de PEG

38 Signaux caractéristiques des échantillons
échantillon précipité microcristallin échantillon non précipité IV

39  division par le facteur de forme
Obtention du facteur de structure phase liquide I(c,s) = I(0,s) x S(c,s) phase solide  division par le facteur de forme IV

40 Indexation des pics de diffraction
(h2+k2+l2) L’espacement des pics de diffraction est compatible avec une maille cubique face centrée a=b=c=390 Å 4 virus dans la maille IV

41 Caractérisation des pics de diffraction
largeur des pics 1/taille des microcristaux nombre de microcristaux N nombre de virus dans les microcristaux n2 hauteur des pics t>0 t>0 temps temps t=0 t=0 la croissance des pics est due principalement à la formation de nouveaux microcristaux la croissance des pics est due principalement à la croissance des microcristaux existants IV

42 PEG 3000 10%, BMV 20 mg/ml IV 1800 Å « 3ème pic » largeur du pic 800Å
temps « 3ème pic » largeur du pic concentration IV

43 Premières conclusions
 Il n’existe que deux espèces en solution : le virus soluble, et le virus cristallisé. Les plus petits microcristaux ont un diamètre de 800 Å (de l’ordre de 20 particules virales)  les noyaux de nucléation ont une structure cristalline, et un diamètre d’environ 800 Å IV

44 On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline
PEG %, BMV 10 mg/ml PEG %, BMV 10 mg/ml Les pics apparaissent plus nombreux et mieux différenciés avec le PEG qu ’avec le PEG 8 000 On ne peut pas distinguer nucléation et croissance cristalline IV

45 Croissance des pics en fonction de la concentration en virus
La hauteur des pics est reliée à la concentration initiale en virus et au nombre de microcristaux. IV

46 Conclusions  L’apparition des microcristaux est directement reliée à: - la taille et la concentration du PEG - la concentration en virus La croissance des pics est principalement due à la formation de nouveaux microcristaux L’apparition puis la croissance des pics de diffraction s ’effectue au cours des premières secondes après le mélange   IV

47 CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

48 L’ARN se plaque contre la paroi interne du virus lors du gonflement de la capside
Déterminer la structure du BMV à partir des cristaux obtenus en présence de PEG La cristallisation du BMV a lieu dans des conditions attractives, qui peuvent être prédites Les noyaux de nucléation des macromolécules sphériques auraient une structure cristalline. Déterminer la forme, sphérique ou plane, des noyaux de nucléation - AFM - cryodécapage

49

50 TF-1 TF-1 TFP Technique de la Transformée de Fourier Polaire (TFP) TF
Baker et Cheng,1996 sélection des particules virales « 2D » conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r,) détermination de l’origine et de l’orientation des particules sélectionnées sélection des particules virales « 2D » projections 2D TF-1 sélection des particules correctement orientées par rapport au nouveau modèle sélection des particules correctement orientées par rapport à la banque de TFP TF-1 Modèle de départ : virus de l’hépatite B (Conway et coll., 1997) conversion des coordonnées cartésiennes (x,y) en coordonnées polaires (r,) TF TF banque de “transformées de Fourier polaires” TFP détermination de l’origine et de l’orientation des particules sélectionnées