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Réactions complexes, en plusieurs étapes: Compatibles avec léquation de Michaelis et Menten?

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1 Réactions complexes, en plusieurs étapes: Compatibles avec léquation de Michaelis et Menten?

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3 A létat stationnaire, par définition: –d(EA)/dt = 0 = k 1 [E][A] + k -2 [EAB]-k -1 [EA]-k 2 [EA][B] –d(EAB-EPQ)/dt = 0 = k 2 [EA][B]+k -3 [EQ][P]-k -2 [EAB-EPQ]-k 3 [EAB-EPQ] –d(EQ)/dt = 0 = k 3 [EPQ]+k -4 [E][Q]-k -3 [EQ][P]-k 4 [EQ] –d(E)/dt = 0 = k -1 [EA] ]+k 4 [EQ] -k 1 [E][A]-k -4 [E][Q] Loi de conservation des masses: E + EA + EAB/EPQ + EQ = E tot Loi daction des masses: à létat stationnaire, v = k 1 [A][E] = k 2 [EA] = k 3 [EAB/EPQ] = k 4 [EQ] Calcul de la vitesse de réaction à létat stationnaire: E EA (EAB EPQ) EQ E

4 Résolution: Système de n équations à n inconnues: résolution par le système des déterminants… Laborieux! Méthodes « simplifiées »: La méthode de King et Altman est la plus simple pour le calcul du dénominateur de léquation représentant la vitesse, v = V max [ES]/[E tot ]; La méthode de Wong et Hanes est plus efficace pour le calcul du numérateur (aucune simplification de termes superflus nest nécessaire).

5 Dénominateur: King et Altman Recherche de léquation, Analyse « topologique » des mécanismes dinhibition par produit

6 1. décrire la vitesse de réaction par une équation de la forme « Michaelis-Menten », cest à dire 2. Distinguer les différents mécanismes réactionnels 3. Prévoir le mode dinhibition par des analogues des différents produits de la réaction (compétitif, non compétitif, etc.) But du jeu:

7 Calcul de [E tot ] : la méthode de King - Altman Posons: La concentration de chacune des formes enzymatiques ([E], [ES], [EP], etc) est proportionnelle à la vitesse à laquelle elle saccumule La concentration totale en enzyme est proportionnelle à la somme des concentrations de toutes les formes possibles ([E tot ]=[E]+[ES]+[EP]+etc) Si on divise [ES] par [E tot ], les constantes de proportionnalité vont sannuler…

8 Méthode Graphique: Remplacer le schéma réactionnel par 1 ou plusieurs cycles fermés: Dessiner tous les patrons qui –Consistent uniquement de lignes du « patron maître » –Connectent toutes les formes enzymatiques –Ne contiennent aucun cycle fermé Chercher puis additionner toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique, pour obtenir leurs vitesses de formation. Additionner les vitesses de formation de toutes les formes enzymatiques pour obtenir « E tot ».

9 Attention: Toutes les constantes cinétiques doivent être de premier ordre (k -1, etc.) ou de pseudo premier ordre (k 1 [A], etc.)! EAB/EPQ k3k3 k1Ak1A EEA EQ A B P k -1 k2Bk2B k4k4 k -2 k -3 P k -4 Q Q A P ou « Master pattern » (patron maître) B Q par 1 ou plusieurs cycles fermés: 1.Remplacer le schéma réactionnel

10 2) Dessiner tous les patrons qui - Consistent uniquement de lignes du « patron maître » OUI: NON - Connectent toutes les formes enzymatiques entre elles - Ne contiennent aucun cycle fermé

11 3) Chercher toutes les combinaisons de réactions qui conduisent à chaque forme enzymatique. Par exemple : les réactions conduisant à « E » sont: E k -1 k4k4 k -3 P k -1 k -2 k4k4 k3k3 k3k3 k4k4 k2Bk2B EEE

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13 Si on groupe tous les facteurs indépendants, tous les multiplicateurs de [A], etc: le dénominateur devient équivalent à la somme:

14 Recherche du numérateur : méthode de Wong et Hanes

15 Recherche du numérateur : méthode de Wong et Hanes Rechercher tous les schémas qui 1.Consistent uniquement en lignes du schéma directeur 2.Connectent toutes les formes denzyme 3.Contiennent une flèche partant de chaque enzyme 4.Contiennent exactement un cycle complet, fermé

16 A k3k3 k1k1 EAB/EPQ EEA EQ B P k -1 k2k2 k4k4 k -2 k -3 k -4 Q A B P Q Le numérateur est la somme algébrique du produit des vitesses du cycle, avec une valeur positive pour le cycle « forward » et une valeur négative pour le cycle « reverse »

17 Equation de forme « Michaelis Menten »? Définition des V max, K M et K i

18 Nous venons dobtenir une équation de la forme: Nous voulions obtenir une équation de la forme:

19 Pour y arriver: définitions des V max, K M et K i

20 Il « suffit » de choisir la définition qui convient le mieux pour simplifier léquation de la vitesse:

21 On obtient une équation du type: Expérimentalement : on varie un seul substrat à la fois: par exemple, [A].

22 Si on divise Numérateur et Dénominateur par les termes indépendants de [A]:

23 diminue avec les termes qui multiplient [A] (reflétant les complexes EAP non productifs) diminue avec les termes indépendants de [A] (reflétant les complexes incapables de reconnaître A) augmente avec les termes indépendants de [A] et diminue avec les termes qui multiplient [A]

24 Rappel: cinétique Michaelienne Michaelis Menten - un substrat, un inhibiteur: Nous avons vu que si il y a –Formation de EI, pas ESI: compétitif –Formation de ESI, pas EI: incompétitif –Formation de EI et ESI : mixte ou non-compétitif

25 Linhibition par produits dépend à la fois du substrat et du produit considéré. Termes en [S]…[P]… : formation de complexes ESI: V max apparente diminue en présence de P (inhibition mixte); Termes en [P]… (pas [S]) : formation de EI : K S apparente diminue K M = V max /K S : si termes [P]… mais pas [S]…[P]… : K M augmente; P inhibiteur compétitif. Inhibition par produits

26 Le type dinhibition par produit peut servir à identifier le mécanisme! Tableau extrait de « Enzyme kinetics » de I. Segel (Wiley and sons, 1975): Varied AVaried B Méchanism Product inhibitor: Unsaturated with B Saturated with B Unsaturated with A Saturated with A Ordered Uni-Bi PMT QC Ordered Bi-Uni PCCMT- Iso Ordered Uni-Bi PMT Q Iso Ordered Bi-Uni PMT Ordered Bi-Bi PMTUCMT QCC - Ping Pong PMT-CC QCC - Etc., etc., etc….

27 Exemple: réaction réversible uni-bi ordonnée : 1.ordonnée: Enzyme + S ES EQ + P E + Q + P 2. aléatoire: EQ + P E + Q + P Enzyme + S ES EP + Q E + Q + P

28 1. Uni-bi ordonnée: Schémas à prendre en compte: dénominateur numérateur E EA/EPQ EQ A P Q

29 A P Q Q

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31 Définitions des K i ? ad hoc:

32 Définitions des K i ? ad hoc:

33 Conclusion: Terme en « P » : K s diminue Terme en « AP »: V max diminue –K M = V max /K S change: P = mixte Terme en « Q », pas « AQ »: V max constant et K S diminue donc K M augmente et Q = compétitif

34 Pyruvate EENADH ENADHPyruvate/LactateNAD + ENAD + NADH Lactate NAD + Est équivalent à: Exemple: réaction bi-bi ordonnée

35 EEA EAB/PQ EQ A B P Q

36 Expérience: incubation avec les 2 substrats et un seul produit (soit P soit Q)

37 Termes P, AP, ABP : –P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A et vis-à-vis de B Termes Q et BQ, pas AQ : –Q = inhibiteur mixte vis-à-vis de B, –Q = inhibiteur compétitif vis-à-vis de A Si A saturant: tous les termes qui ne contiennent pas « A » vont disparaître (trop petits comparés aux autres). Il reste : –Termes (A)P et (A)BP donc P reste inh. mixte vis-à-vis B; –Pas de termes AQ, donc levée dinhibition par Q Si B saturant: même raisonnement –Termes A(B)P mais pas (B)P donc P devient incompétitif vis-à- vis de A –Termes (B)Q donc Q reste compétitif vis-à-vis A

38 Réaction bi-bi ordonnée

39 Réaction uni-uni,uni-uni « ping pong »

40 Termes P, AP, pas BP : –P = inhibiteur mixte vis-à-vis de A, compétitif vis-à-vis de B Termes Q, BQ, pas AQ : –Q = inhibiteur mixte ou non compétitif vis-à-vis de B, compétitif vis-à-vis de A Si A saturant: –Termes AP donc P reste compétitif vis-à-vis B; pas termes AQ donc linhibition par Q est levée Si B saturant: –Pas termes BP donc linhibition par P est levée; termes BQ donc Q reste compétitif vis-à-vis A

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42 Mécanismes complexes: 1.Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit dadditionner les vitesses de ces réactions 2.Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés 3.Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques 4.Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats 2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent 5.Si plusieurs états de lenzyme sont à léquilibre pendant la réaction, il suffit dutiliser des constantes de vitesse pondérées

43 k1Ak1A k -1 k -2 P k2k2 E EA=EP Enzyme Michaelienne:

44 Mécanismes complexes: 1.Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit dadditionner les vitesses de ces réactions 2.Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés 3.Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques 4.Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats 2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent 5.Si plusieurs états de lenzyme sont à léquilibre pendant la réaction, il suffit dutiliser des constantes de vitesse pondérées

45 15 schémas possibles contenant (n-1) lignes (n étant le nombre de formes enzymatiques), mais 4 sont éliminés car au moins 1 cycle fermé)

46 Mécanismes complexes: 1.Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit dadditionner les vitesses de ces réactions 2.Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés 3.Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques 4.Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats 2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent 5.Si plusieurs états de lenzyme sont à léquilibre pendant la réaction, il suffit dutiliser des constantes de vitesse pondérées

47 k2Pk2P k4Pk4P k1Ak1A k -1 k3Ak3A k -3 k1Ak1Ak -1 k2Pk2P k3Ak3Ak -3 k4Pk4P Est équivalent à: 2k 4 P 2k 2 P 2k 1 A 2k -1 2k 3 A 2k -3

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49 Mécanismes complexes: 1.Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit dadditionner les vitesses de ces réactions 2.Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés 3.Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques 4.Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats 2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent 5.Si plusieurs états de lenzyme sont à léquilibre pendant la réaction, il suffit dutiliser des constantes de vitesse pondérées

50 EA EB EQEP E + +

51 Pour trouver le dénominateur, identifier : tous les cycles ouverts menant au point de contact et tous les cycles ouverts qui le quittent: ++ EEE E EE EA EP

52 Ensuite : additionner les combinaisons: « matrice gauche*matrice droite » + « matrice droite*matrice gauche » E + E E+ E EA +EA + E EA + EP +EPEP + * * + E E + EAEA E + E + EA EP+ EP + [E tot ] ~

53 Le numérateur est obtenu en incluant un cycle complet par terme, avec un signe positif pour le cycle « forward » et un signe négatif pour le cycle « reverse » * *

54 Remarque: impasse? EB EQEP E

55 Mécanismes complexes: 1.Si deux ou plusieurs réactions conduisant au même résultat: il suffit dadditionner les vitesses de ces réactions 2.Si deux voies alternatives coexistent: additionner tous les schémas possibles ne contenant pas de cycles fermés 3.Deux réactions conduisant au même résultat: grouper les réactions équivalentes en introduisant des facteurs statistiques 4.Cycles alternatifs (par exemple: 2 substrats 2 produits): Multiplier la vitesse des réactions qui quittent le point de contact par la vitesse des réactions qui y arrivent 5.Si plusieurs états de lenzyme sont à léquilibre pendant la réaction, il suffit dutiliser des constantes de vitesse pondérées

56 Exemple: effet du pH HE + HE + PHE + A E0E0 E0E0 E0PE0PE0AE0A k2k2 k1Ak1A k -1 k -3 Pk -2 k -1 k3k3 KEKE k1Ak1A k2k2 k -2 k -3 P k3k3

57 Les constantes de vitesse peuvent sécrire: Et la vitesse dassociation de A vaut:

58 Est donc équivalent à: E (H) E0E0 E0PE0PE0AE0A avec des constantes de vitesse « pondérées » en fonction de [H + ] HE + HE + PHE + A E0E0 E0E0 E0PE0PE0AE0A k2k2 k1Ak1A k -1 k -3 Pk -2 k -1 k3k3 KEKE k1Ak1A k2k2 k -2 k -3 P k3k3

59 Un exemple de cinétique « non Michaelienne »: la réaction bi-bi aléatoire:

60 A B A P Q Q P B EP E EB EA EAB EQ

61 Etc. A A B2B2 A2A2 B2B2 B2B2 B2B2 A2A2 B2B2 Cinétique non Michaelienne: Termes en A 2, B 2, P 2 et Q 2... A2A2

62 En pratique: De très nombreux termes supplémentaires apparaissent au dénominateur et au numérateur si lordre de liaison des substrats est aléatoire; La cinétique nest plus « Michaélienne » et peut donner lapparence dune réaction catalysée par deux enzymes différentes. La déviation est cependant souvent non-détectable. En effet, comme les concentrations de A, B sont faibles (<< 1M), les termes en A 2, B 2 deviennent négligeables devant les termes en A, B (à moins que la voie qui donne naissance à ces termes ne soit particulièrement favorable)...

63 Réaction bi-bi aléatoire: si la liaison de A, B, P et Q est instantanément à léquilibre, la réaction peut sembler « Michaelienne »: A léquilibre Lent

64 Cinétique de type « Michaelienne » si mécanisme ordonné; Cinétique peut-être visiblement « non Michaelienne » si ordre réactions aléatoire: peut donner limpression que deux enzymes de K M et V max différentes participent à la réaction… Le profil dinhibition par les produits peut servir à diagnostiquer le type de mécanisme: voir les exemples que nous avons étudié Résumé: réactions à deux ou plusieurs substrats:

65 Résumé: les réactions à deux substrats que nous avons étudiées: AB Produit:B non saturant B saturantA non saturant A saturant Ping Pong PQPQ Mixte Comp - Comp Mixte Comp - Bi-Bi ordonné PQPQ Mixte Comp Incomp Comp Mixte - Bi-Bi Aléatoire (liaison « instantannée » de A,B,P et Q sur E) PQPQ Comp

66 En conclusion: 1.La réaction na lieu que si tous les substrats sont présents 2.Cinétique « Michaélienne? –Oui, si un seul cycle réactionnel possible: chaque substrat (ou produit) nintervient quune seule fois dans chaque terme. –Non si plusieurs cycles utilisent le même substrat: des termes du type « [A] n » vont vraisemblablement apparaître. 3.La V max apparente pour chaque substrat (vitesse approchée lorsque la [A] tend vers linfini) augmente avec la concentration des autres substrats 4.Le K M apparent de chaque substrat dépend de la concentration des autres substrats

67 Remarques: –Si le but est de déterminer le mécanisme de la réaction, il nest pas nécessaire de développer l équation complète (en fait, toutes les équations décrivant les mécanismes les plus classiques ont déjà été développées): un raisonnement « topologique » suffit pour prédire les propriétés cinétiques de la réaction pour chaque mécanisme… –Plusieurs définitions de K i sont en général possibles pour chaque produit ou substrat: il faut choisir celle qui semble la plus appropriée pour écrire léquation de « v » –La V max (mesurée en présence de concentrations saturantes de tous les substrats) dépend uniquement des vitesses de dissociation des produits!


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