Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache.

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1 Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés
M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080 Bât. 445 Université Paris XI, ORSAY PUBLICATIONS Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J. Comp. Neurol. 481(4):331-9. Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport . 15(17): Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004) . Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Development 131: Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61: Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130: Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28:411-9. Détermination des cellules rétiniennes Etude du transcriptome des cellules souches rétiniennes collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne) OBJECTIF Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels. collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud Les précurseurs rétiniens sont à l’origine de la rétine neurale et de l’épithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller). Cellules souches Neuroblastes Précurseurs en différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC Epithélium pigmenté Rétine neurale Nerf optique Cristallin Cascade de signalisation Notch/Delta: Étude d’un nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2 DNA + GFP DNA Dotap Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de l’animal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de l’animal, mais a aussi l’avantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire. Jusqu’en 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que l’épithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes. LES CONSTRUCTIONS HES2 Technique de lipofection in vivo XHes2 Groucho helix loop helix WRPW basique orange HC OBJECTIF Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire. Notre projet constiste donc à: rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes Intérêts du xénope: Approche in vivo Approche à grande échelle Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine XHes2-∆WRPW (dominant négatif) XHes2-∆WRPW-VP16 (antimorphe) domaine d’activation de VP16 SPECIFICATION NEURONALE 80 Témoin 70 * % de cellules * ∆WRPW 60 * 80 * VP16 * XHES2 60 * Témoin 1244 cellules 11 rétines 40 Témoin XHes2 * * 40 30 * * * 4 * GLIOGENESE NEUROGENESE * * * * ∆WRW * * XHes2 939 cellules 13 rétines * 20 * * * * 20 * * * * * * 2 VP16 10 * * * Types cellulaires: Müller amacrine bipolaire Cellules de Muller horizontale ganglionnaire photorecepteur Müller amacrine bipolaire horizontale ganglionnaire photorecepteur L’inhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse Crible par hybridation in situ chez tropicalis La surexpression de Xhes2 favorise la gliogenèse L’inhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis Séquençage (Génoscope) de clones Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): gènes Préparation des sondes et crible in situ Post-mitotic cells Dividing cells GCL IINL OINL PRL xrp1 Xseb4R nrp1 etr-1 elrB elrC elrD 1 2 3 4 Xrp1 hermes RPE RNA binding proteins RRM 1 Xseb4R nrp-1 xrp1 elrB, C, D etr-1 Musashi Elav/Hu Bruno RRM 3 RRM 2 « RNA binding proteins » elrB, C, D xrp1 Nrp-1 Xseb4R Etr-1 A B C D E F G H A B C D E F G H 10 20 30 40 50 % of retinal cells * Ganglion cells Amacrine Bipolar Horizontal Photoreceptor Müller control 1799 cells Xseb4R 1630 cells La distribution des “RNA binding proteins” dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens. Transcription des sondes DIG anti-sens Amplification par PCR des clones d’une plaque 96 puits Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans l’œil + DEX - DEX INDUCED AT ST 10,5 - 11 Ntubulin expression Control Mo Xseb4R Mo * control Mo 925 cells Xseb4R Mo 476 cells % of retinal cells Ganglion cells Amacrine Bipolar Horizontal Photoreceptors Müller 10 20 30 40 Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine Candidats potentiels déjà disponibles Xseb4R aurait aussi un rôle “proneural” au cours de la neurogenèse primaire Musashi: nrp1, xrp1: voir partie “RNA binding proteins” Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al. La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a l’effet opposé