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Cellules souches Neuroblastes Précurseurs en différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC Epithéliumpigmenté Rétine neurale Nerfoptique Cristallin.

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1 Cellules souches Neuroblastes Précurseurs en différenciation ZMC = zone marginale ciliaire ZMC Epithéliumpigmenté Rétine neurale Nerfoptique Cristallin Etude du transcriptome des cellules souches rétiniennes Candidats potentiels déjà disponibles Musashi: nrp1, xrp1: voir partie RNA binding proteins Cascade Hedgehog: voir poster Hedgehog, Amato et al. Crible par hybridation in situ chez tropicalis AB CD EF G H AB C D E F G H Chez les amphibiens, la rétine croît pendant toute la vie de lanimal par addition de nouvelles cellules de tous types au niveau de la zone marginale ciliaire. La ZMC est la région annulaire située aux extrémités de la rétine, composée de cellules souches, de rétinoblastes et de précurseurs neuraux en différenciation. La ZMC est non seulement accessible pour des analyses expérimentales pendant toute la vie de lanimal, mais a aussi lavantage exceptionnel de présenter des cellules ordonnées spatialement selon le développement et la différenciation cellulaire. Jusquen 2000, les cellules souches de la rétine avaient été identifiées uniquement dans la ZMC des poissons et des amphibiens. Cependant, il a récemment été montré que lépithélium pigmenté du corps ciliaire de la rétine des mammifères adultes contient des cellules souches rétiniennes. OBJECTIF Etant données les applications potentielles des cellules souches rétiniennes dans des interventions thérapeutiques de dystrophies rétiniennes, il est important de caractériser davantage ces cellules souches rétiniennes au niveau moléculaire. Notre projet constiste donc à: rechercher par hybridation in situ des gènes exprimés dans les cellules souches de la ZMC de la rétine de xénope étudier le rôle de ces gènes dans la maintenance et le potentiel de différenciation de ces cellules souches rétiniennes Intérêts du xénope: Ø Approche in vivo Ø Approche à grande échelle Banque de rétine et de cerveaux de bourgeons caudaux de Xenopus tropicalis Séquençage (Génoscope) de clones Assemblage des séquences (N. Pollet; R. Thuret): gènes Préparation des sondes et crible in situ Amplification par PCR des clones dune plaque 96 puits Transcription des sondes DIG anti-sens Hybridation in situ sur embryons entiers de Xenopus tropicalis et coupes au vibratome des embryons présentant une expression dans lœil Rétinogenèse chez le xénope: des cellules souches aux neurones différenciés Détermination des cellules rétiniennes Les précurseurs rétiniens sont à lorigine de la rétine neurale et de lépithélium pigmenté rétinien. La rétine neurale contient six types de neurones (cônes, bâtonnets, amacrine, bipolaire, horizontale et ganglionnaires) et un type de cellules gliales (Müller). XHes2 Groucho helix loop helix orange HC WRPW basique LES CONSTRUCTIONS HES2 XHes2-WRPW (dominant négatif) XHes2-WRPW-VP16 (antimorphe) domaine dactivation de VP16 WRPW VP16 Témoin XHes Cellules de Muller ganglionnaire amacrine bipolaire horizontale photorecepteur Müller Témoin 1244 cellules 11 rétines XHes2 939 cellules 13 rétines % de cellules Types cellulaires : * * * * * * * * * * * * * ** WRW VP16 Témoin * * * * * * * * ** * * * * * * * ganglionnaire amacrine bipolaire horizontale photorecepteur Müller OBJECTIF Dans le but de mieux comprendre les cascades géniques impliquées dans le choix de la destinée de ces précurseurs rétiniens, nous avons étudié les rôles joués par les cascades de signalisation Hedgehog et Notch/Delta, ainsi que le rôle joué par des facteurs post-transcriptionnels. Amato, M.A., K. Koebernick, T. Pieler, W.A. Harris and and Perron, M. Hedgehog signaling controls the maintenance of stem cell/progenitor proliferation in Xenopus retina. Soumis. Amato, M.A., Boy, S., Arnault, E., A, Girard, M., Sharif, A., Dellapuppa, A. and Perron, M. (2005). Comparison of the expression patterns of five neural RNA binding proteins in the Xenopus retina. J. Comp. Neurol. 481(4): Agnès, F. and Perron, M. (2004). RNA binding proteins and neural development: a matter of targets and complexes. NeuroReport. 15(17): Amato M.A., Arnault E. and Perron M. (2004). Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences. Int. J. Dev. Biol. "Eye development" special issue 48: Boy S., Souopgui J., Amato M.A., Wegnez M., Pieler T. and Perron M. (2004) XSEB4R, a novel RNA-binding protein involved in retinal cell differentiation downstream of bHLH proneural genes. Development 131: Amato M.A., Boy S. and Perron M. (2004) Hedgehog signalling in vertebrate retinal development: a growing puzzle. Cell Mol Life Sci 61: Perron M, Boy S, Amato MA, Viczian A, Koebernick K, Pieler T, Harris WA. (2003). A novel function for Hedgehog signalling in retinal pigment epithelium differentiation. Development 130: Ohnuma S, Mann F, Boy S, Perron M, Harris WA. (2002). Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods 28: RNA binding proteins RRM 1 Xseb4R nrp-1 xrp1 elrB, C, D etr-1 Musashi Elav/Hu Bruno RRM 3RRM 2RRM 1 RRM 2 Post-mitotic cells Dividing cells GCL IINL OINL PRL xrp1 Xseb4R nrp1 etr-1 nrp1 elrB elrC elrD Xseb4R nrp1 elrB elrC elrD etr-1 Xrp1 hermes etr-1 xrp1 etr-1 Xseb4R nrp1 elrC nrp1 RPE nrp % of retinal cells * * * * * * * * * * * * * * * Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Photoreceptor cells Müller cells control 1799 cells Xseb4R 1630 cells * * * * control Mo 925 cells Xseb4R Mo 476 cells % of retinal cells Ganglion cells Amacrine cells Bipolar cells Horizontal cells Photoreceptors cells Müller cells Ntubulin expression Control MoXseb4R Mo + DEX - DEX INDUCED AT ST 10, Technique de lipofection in vivo DNA + GFP DNA + Dota p Expression du gène Xhes2 très régionalisée, dans les vésicules optiques et otiques Expression du gène Xhes2 dans la zone marginale ciliaire de la rétine Cascade de signalisation Notch/Delta: Étude dun nouveau gène de la famille hairy/enhancer of split, Xhes2 « RNA binding proteins » La surexpression de Xhes2 favorise la gliogenèse Linhibition de Xhes2 diminue la gliogenèse Linhibition de Xhes2 affecte la distribution des différents types de neurones XHES2 GLIOGENESENEUROGENESE SPECIFICATION NEURONALE elrB, C, D xrp1Nrp-1Xseb4REtr-1 Xseb4R est le premier facteur post-transcriptionnel, positionné dans la cascade de neurogenèse, à avoir un rôle dans la détermination des neurones rétiniens Expression du gène Xseb4R dans la zone marginale ciliaire de la rétine Laboratoire Gènes, Développment et Neurogenèse, UMR CNRS 8080 Bât. 445 Université Paris XI, ORSAY PUBLICATIONS collaboration avec E. Bellefroid (Belgique); K. Koebernick; M. Solter; Jacob Souopgui et Tomas Pieler (Allemagne) collaboration avec Nicolas Pollet; Raphaël Thuret; Qods Ymlahi Ouazzani et André Mazabraud La surexpression de Xseb4R dans la rétine a un effet proneural, sa perte de fonction a leffet opposé Xseb4R aurait aussi un rôle proneural au cours de la neurogenèse primaire La distribution des RNA binding proteins dans la rétine suggère que, comme les facteurs de transcription, ces régulateurs post-transcriptionnels jouent des rôles importants à toutes les étapes de la rétinogenèse et dans tous les neurones rétiniens. M. Amato; S. Boy; A. della Puppa; Y. Aoki; N. Grandchamp; M. Segalen; J. Hamdache et M. Perron


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