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Compter des Microorganismes. Méthodes Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs.

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1 Compter des Microorganismes

2 Méthodes Comptes viables Nombre le plus probable Comptes directs

3 Nombre le Plus probable: NPP –Fondé sur les statistiques de probabilités –Test présomptif fondé sur des caractéristiques données –Technique en bouillon

4 Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon pour déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de léchantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution 3 Tubes/Dilution 1 ml de chaque Dilution dans chaque Tube Après une période dincubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées)

5 NPP- Suite Les résultats – – N o de tubes (+) Objectif est de DILUÉ à zero lorganisme Choisir la série la moins dilué qui sont tous négatifs –Dans cet exemple (-5) Obtenir les résultats des 3 dilutions précédente –Dans cet exemple (-2, -3, et -4) –Determiner le nombre de tubes positifs pour chacune de ces dilutions Dans cet exemple (3, 2, 1 respectivement) Determiner le NPP sur le tableau de NPP

6 NPP = 1.5 UFC/ml pour la dilution 10 -3

7 NPP Calculs –Si 3, 2,1 Donc le résultat est: 1.5/ml or g –Puisque ceci est une estimé pour la dilution de nous devons multiplier par –Notre résultat 1.5 UFC/g ou ml 1.5 x 10 3 UFC/g ou ml

8 Comptes Directes Léchantillon à être énuméré est appliqué sur une lame dhémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé

9 Comptes sur Hémacytomètre Cette lame possède 2 cellules de comptages indépendantes, chacune dun volume de 0.1 mm 3 quand elles sont recouverte dune lamelle

10 Application à la Lame dHémacytomètre Remplir la cellule avec la suspension a être compté Laisser la cellule se remplir par capillarité Ne pas forcer le remplissage avec de la pression Lamelle

11 Déterminer le Compte Direct 11 Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants –8, 8 et 5 Déterminer la moyenne –( )/3 =7 –Donc 7 cellules/carré

12 Déterminer le Compte Direct (suite) 12 Calculer le volume dun carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X cm 3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume dun carré –Donc 7/ 1 X ml = 7 X 10 4 cellules/ml 1mm Depth: 0.1mm

13 Avantages: –Rapide –Culture pas nécessaire –Aucune info préalable nécessaire Limitations: –Ne distingue pas vivant de mort –Difficile de distinguer bactéries de détritus

14 Problème Un échantillon de 500μl est appliqué à une lame dhémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans léchantillon original si la cellule de comptage possède 100 carrés?

15 Microscopie Colorations

16 Coloration Différentielle Coloration de Gram Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives

17 Gram Positives Colorées Bleu –Bacille Genres Bacillus et Clostridium –Coccus Genres Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus

18 Gram Négatives Colorées Rouges –Bacille: Genres Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. –Coccus: Genres Neisseria, Pneumococcus et Meningococcus

19 Paroi Cellulaire 19 Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique Couche de Lipopolysaccharide Absente Gram + Vs Gram -

20 Méthode - Coloration Primaire 1.Coloration avec le cristal violet 2.Ajout diode de Gram (Mordant) + Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS

21 Méthode - Étape Différentielle 3.Lavage à alcool Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS Paroi est déshydratée – Complex colorant + iode est piégé Paroi nest pas déshydratée – Complex nest pas piégé

22 Méthode - Contre Coloration 4.Coloration avec la Safranine 22 Gram positifGram Négatif Membrane plasmique Paroi :peptidoglycane LPS

23 Sommaire 23 Fixation Coloration primaire Violet de cristal Contre coloration Safranine Lavage Décoloration

24 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium –Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre –Paroi cellulaire avec acide mycoïque 24

25 Méthode Principe: –Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants 25

26 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique –Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de lalcool acide –Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant 26

27 Coloration de Spores Spores: –Cellule bactérienne différentiée –Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques –Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium –Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à lendospore 27

28 Coloration au Vert de Malachite Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine 28 Cellules végétatives Spores Endospore Sporangium


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