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Chercheur de Métaphases au CHU de REIMS. Organisation du laboratoire de cytogénétique et génétique du CHU REIMS Secteur constitutionnel, hématologique.

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1 Chercheur de Métaphases au CHU de REIMS

2 Organisation du laboratoire de cytogénétique et génétique du CHU REIMS Secteur constitutionnel, hématologique et fish (4,5 techniciennes) En 2009: 600 caryo constit métaphasiques /prométaphasiques 800 caryo hémato 1100 FISH hémato et constit Secteur prénatal et tumeur (1,8 techniciennes) En 2009 : 900 caryo Secteur BM (1,5 techniciennes + 1 ingénieur « puce CGH array »)

3 Évolution des caryotypes en 5 ans hématologieFISHconstitutionnel évolution 60% 53% 15%

4 Equipement et imagerie Un chercheur de métaphase + chargeur 80 lames 4 microscopes « captures manuelles » + logiciels danalyse dimages Ikaros® et Isis® 2 microscopes lecture de FISH « captures manuelles »équipé dune platine de relocalisation de mitose

5 Utilisation du Métafer® Tous les caryo hémato bandes G et R 80% des lames de FISH (métaphasique et interphasique), sondes commerciales, bac. Peu de caryo constitutionnels…

6 Station metafer® + chargeur 80 lames ( 2m10 en longueur x 80 cm en profondeur)

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10 Temps de capture Plateau de 8 lames en lumière blanche 1)Recherche des mitoses obj x10 2)Choix des mitoses + autocapture à lobj x60 3)Transfert des images ± 1h30 FISH métaphasique De 10 min à 30 min / lame en fonction du nombre de mitoses voulu FISH interphasique ± 30 min / lame (pour une recherche min de 200 à 300 noyaux)

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12 Entrées des dossiers

13 Paramètres de calibration et dentraînements des lames Création de programmes de recherches Recherche obj x10, détection des mitoses – Lames bandes G et R (classifiers hémato, constit, LA,etc…) – Lames de FISH (dapi) Autocapture obj x63 : relocalisation des mitoses – classifiers pour les mitoses très étalées (HRC) – Classifiers pour les différents types de fluorochromes en FISH

14 Création de programmes de recherches FISH interphasique (objx40) – Types de cellules à détecter (lymphocytes, LCR,cellules buccales ) – Sondes monolocus monocolore ou bicolore (break- appart) – Sonde de fusion – Type de fluorochrome

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26 Paramètres variant en FISH interphasique Sensibilité (seuil de détection) Largeur des spots Limite despacement entre 2 spots dune sonde bicolore (impliquant ou non une translocation ou une inversion) Nombre de champs à screener Prise en compte ou non des noyaux avec 0 spot (double délétion)

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28 MLL IGH

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31 Clone 1 Clone 2 Clone 3

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34 AVANTAGES Moins de lecture au microscope et dégagement de temps souplesse dorganisation au microscope Sensibilité et détection ++ Souplesse dutilisation pour les confirmations de petits clones hématologiques ++ Possibilité de relocaliser facilement des mitoses Rendu plus rapide des caryo hémato « screenés » le jour même de la coloration

35 AVANTAGES Utilisation du chargeur de lames la nuit notamment en FISH interphasique (30 min /lame) Choix de la zone de lecture notamment en FISH (plusieurs sondes sur une lame) Lecture « rapide » des M-FISH Programmes adaptés aux sondes (sonde de fusion,M- FISH, type de fluorochrome) Compte rendu danalyse précis en FISH interphasique avec les clones hémato Toutes les recherches sont stockées dans le disque dur

36 INCONVENIENTS Plusieurs mois dadaptation et de paramétrage Nécessité de mettre à jour les logiciels de traitement dimage sur chaque poste danalyse Proximité de lautomate indispensable Qualité des étalements importante (étaleur) Huile +++ Mitoses incomplètes en constitutionnel et prénatal ++

37 INCONVENIENTS Difficulté dinterprétation pour certaines sondes Diagramme interphasique parfois assez fastidieux à corriger FISH ou lumière blanche prévoir une organisation au sein du labo

38 conclusion Après 2 ans dexpérience: Devenu indispensable en cytogénétique hématologique et en FISH A optimiser pour nos caryotypes constitutionnels et prénatals


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