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Opération Biopuces Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003.

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1 Opération Biopuces Resp : Pr. J.R. Martin Site en cours de construction Version du 15/12/2003

2 Axes de recherche du groupe Biopuces Fonctionnalisation & optimisation des supports Fonctionnalisation & optimisation des supports Conception & réalisation de biopuces Conception & réalisation de biopuces Puces à oligonucléotides Puces à oligonucléotides Puces à protéines Puces à protéines Mise en oeuvre des biopuces Mise en oeuvre des biopuces Nouvelles méthodologies Nouvelles méthodologies

3 Fonctionnalisation & optimisation des supports Chimie de surface sur support verre ou silicium silice Chimie de surface sur support verre ou silicium silice Silanisation et fonctionnalisation pour : Silanisation et fonctionnalisation pour : - Immobilisation des oligonucléotides - Synthèse in situ Approche physicochimique Approche physicochimique Approche physique Approche physique

4 Conception, fabrication & mise en œuvre de biopuces Sélection de sondes par bioinformatique Sélection de sondes par bioinformatique Développement des protocoles de matériel biologique Développement des protocoles de matériel biologique Fabrication de puces de validation par synthèse in situ Fabrication de puces de validation par synthèse in situ Lecture dynamique de puces à ADN Lecture dynamique de puces à ADN Deux applications : Deux applications : GénotypageGénotypage Expression de gènesExpression de gènes

5 Conception automatisée de séquences sondes pour le génotypage sur puce Analyse dimage pour linterprétation de biopuces de génotypage Outils informatiques pour la conception, lanalyse et la validation expérimentale de biopuces de génotypage

6 Puces à oligonucléotides (1/5) Le groupe Biopuces développe depuis 1997 des procédés de fabrication de puces à oligonucléotides par microprojection de réactifs. Deux échelles réactionnelles : 5 nanolitres, 3 picolitres Deux procédés : Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideImmobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solideSynthèse in situ de sondes oligonucléotidiques sur support solide

7 Puces à oligonucléotides (2/5) Immobilisation ex situ de sondes oligonucléotidiques Dispositif expérimental ½ Batterie avec 128 moyens de microprojection Grande vitesse de fabrication (50 puces/h) Absence de contamination Fabrication de puces à ADN pour le diagnostic : production de masse

8 Optimisation de la densité de greffage des sondes / processus d évaporation dune goutte projetée : nano-mouillage T ambiante : 22.5°C Humidité : 43%RH

9 Puces à oligonucléotides (3/5) Synthèse in situ de sondes oligonucléotidiques basse à moyenne intégration Dispositif expérimental Chimie des phosphoramidites Projection des nucléotides (5nl) Fabrication rapide et flexible de puces en quelques exemplaires : conception de biopuces, mise au point de protocoles biologiques

10 Puces à oligonucléotides (4/5) Synthèse in situ des sondes oligonucléotidiques par la voie des phosphoramidites : adaptation du cycle de synthèse Couplage localisé par microprojection de la base et de lactivateur Autres réactions non localisées par microfluidique Réacteur anhydre et saturé en solvant

11 Puces à oligonucléotides (5/5) : synthèse in situ haute intégration Dispositif expérimental en cours de développement Chimie des phosphoramidites Projection des nucléotides (3 picolitres)

12 Biopuces pour la protéomique (1/2) Fixation contrôlée de peptides sur support plan : peptides synthétiques fixés par couplage covalent orienté sur supportpeptides synthétiques fixés par couplage covalent orienté sur support Objectif : réalisation dédifices dendrimériquesObjectif : réalisation dédifices dendrimériques Applications : Applications : Reconnaissance de protéines pour diagnostic immunologiqueReconnaissance de protéines pour diagnostic immunologique Programmes : Programmes : CNRS Protéomique ; Région RA Méthodologies analytiques ;CNRS Protéomique ; Région RA Méthodologies analytiques ; Partenaires Partenaires Rosatech, Université Lyon I (LBASB, LBCP), EFS, ProtéineXpertRosatech, Université Lyon I (LBASB, LBCP), EFS, ProtéineXpert Peptides fixés solvant Peptides non activés Validation de la chimie de couplage (fluorescence, IR) Objectif : immobilisation de dendrimères peptidiques

13 Biopuces pour la protéomique (2/2) : Biopuces pour la protéomique (2/2) : Synthèse « in-situ » localisée doligopeptides Schéma de couplage Synthèse des Fmoc AA -Fmoc Activateur (DCC) Etape 1 Rinçage Etape 2 Déprotection du Fmoc Etape 3 Rinçage Etape 4 N-alpha-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-Alanine O O n O O NH2 n Principe: adapter le procédé de synthèse in situ de biopuces du LEOM à la chimie des Fmoc

14 Nouvelles méthodologies Optimisation de lhybridation des biopuces : micromélange & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solide Optimisation de lhybridation des biopuces : micromélange & microfluidique, étude cinétique des interactions cibles/sondes sur support solide Lecture dynamique des puces à ADN Lecture dynamique des puces à ADN Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées Systèmes moléculaires autofluorescents : étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées Etude du comportement de biomolécules sur support solide Etude du comportement de biomolécules sur support solide Biocapteurs Biocapteurs

15 Etude du comportement de biomolécules sur support solide Analyse cinétique de reconnaissance entre biomolécules Détection de SNP sur support solide : discrimination de deux cibles à un nucléotide prêt fluorescence Position X

16 Biocapteurs dADN Cartographie dimpédance optoélectrochimique pour la reconnaissance biomoléculaire

17 Principaux programmes de recherche Outils de conception et de fabrication de biopuces pour la protéomique, Programme de Recherche Région Rhône-Alpes, Thématique Prioritaire : Sciences Analytiques Appliquées (2003/2005) Puces ADN : étalement de gouttes avec évaporation et mécanismes réactionnels, modélisation mathématique et numérique, PIR CNRS : Microfluidique et Microsystèmes fluidiques (2003/2004) Micro-mélangeur à advection chaotique pour une hybridation optimisée des biopuces, FITT (2003/2004) Puces à ADN pour le diagnostic génétique, Programme GENHOMME (2002/2004) Conception et Validation dune biopuce à PNA pour la traçabilité génétique des agents pathogènes, développement de léquipement danalyse associé, Programme MENRT (2002/2004) Autofluorescence & système moléculaire autofluorescent pour l'étude cinétique d'interactions spécifiques entre biomolécules non marquées, ACI Nouvelles méthodologies analytiques et capteurs (2002/2004) Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (Multiple Antigen Peptide), Programme CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) Conception, synthèse et évaluation de puces à protéines sur support fonctionnel de type MAP (Multiple Antigen Peptide), Programme CNRS Protéomique et génie des protéines (2002/2003) Micro-mélangeur à advection chaotique pour lhybridation des biopuces, Bonus Qualité Recherche 2002 (2002/2003) Machine de production de puces à ADN 256 sondes par microdéposition, Programme ANVAR de transfert de technologie (2001/2003) Réalisation dune puce à ADN pour létude du transcriptome de Buchnera Aphidicola, Bonus Qualité Recherche 2001 (2001/2002)

18 Principaux programmes de recherche Projet ROSA2 (Réseaux dOligonucléotides pour le Séquençage dADN) du programme Puces à ADN du CNRS ( ) Projet ROSA2 (Réseaux dOligonucléotides pour le Séquençage dADN) du programme Puces à ADN du CNRS ( ) Faisabilité d'un réacteur pour la fabrication de réseaux d'oligonucléotides par synthèse chimique parallèle localisée par microdéposition, Programme CNRS MICROSYSTEMES (1999/2000) Projet ROSA (Réseaux dOligonucléotides pour le Séquençage dADN) du programme GENOME du CNRS ( ) Projet ROSA (Réseaux dOligonucléotides pour le Séquençage dADN) du programme GENOME du CNRS ( )


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