Ludovic Lemée, Bactériologie CHU Rouen ANALYSES BACTERIOLOGIQUES DES SECRETIONS BRONCHOPULMONAIRES AU COURS DE LA MUCOVISCIDOSE. Ludovic Lemée, Bactériologie CHU Rouen

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES SECRETIONS BRONCHOPULMONAIRES DU PATIENT ATTEINT DE MUCOVISCIDOSE Pourquoi c’est particulier ? (muco vs. non muco) Le prélèvement Les germes recherchés Les seuils de détection L’identification des bactéries Les tests antibiotiques (et tests complémentaires) La durée d’analyse / délai de rendu Pourquoi prélever ? Pourquoi c’est long ? Pourquoi c’est difficile ? Pourquoi une reproductibilité douteuse ? Pourquoi manque corrélation in vitro / in vivo tests ATB ?

PRELEVEMENT Contamination salivaire Flore bactérienne Référence : LBA!!! Expectoration spontanée ou induite Asp. nasopharyngée, écouvillon pharyngé…? Délai de transport ? EXAMEN DIRECT Contamination salivaire Leucocytes / cellules épithéliales Quelle valeur dans la mucoviscidose? Flore bactérienne Élément d’orientation de la thérapeutique?

Homogénéisation du prélèvement : problèmes de détection de souches. Mr M., ECBC septembre 2003: - S.aureus 107/ml - H. influenzae 106/ml - Flore commensale par ailleurs (Juillet 2003: porteur de 2 souches de P. aeruginosa)  Ensemencement à l’écouvillon d’une gélose pour ATBG: - Idem, plus - 2 Pseudomonas aeruginosa (multisensibles) - Stenotrophomonas maltophilia (multirésistant)

Panel de milieux sélectifs et non sélectifs Germes recherchés ENSEMENCEMENT Panel de milieux sélectifs et non sélectifs S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus (y compris variants à petites colonies), P. aeruginosa, B. cepacia, autres BGN non fermentants... 7 géloses différentes !

DETECTION ET NUMERATIONS BACTERIENNES SEUILS DE DETECTIONS DETECTION ET NUMERATIONS BACTERIENNES Seuils de détection de la primocolonisation: 102/ml P. aeruginosa traitement agressif de la primocolonisation B. cepacia prévention des transmissions croisées S. aureus détection de SARM Seuils de significativité: 105/ml H. influenzae, S. pneumoniae, Entérobactéries, Aérobies stricts autres que P. aeruginosa

Détecter le plus tôt possible, pour traiter tôt, avant colonisation / infection chronique

Pseudomonas aeruginosa : « Quorum Sensing »  augmentation densité bactérienne  hyperexpression des facteurs de virulence et induction mode biofilm

Conséquences thérapeutiques « Quorum Sensing » : Conséquences thérapeutiques  Traitement précoce de la primocolonisation à pyo et de la phase de colonisation intermittente (éviter que le biofilm ne se constitue et donc que l ’inoculum n ’augmente trop vite)  traitements ATBs réguliers, même en l’absence signe clinique, pour maintenir l ’inoculum bactérien le plus faible possible dans les bronches.  utilisation des macrolides (voire de certaines fluoroquinolones), qui semblent perturber le quorum sensing

Détection de souches en faible densité P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (4) Détection de souches en faible densité  P. aeruginosa 102/ml signifie 1 seule colonie sur la gélose  Au seuil de détection (102/ml) : présence statistiquement « aléatoire »  Repérage difficile d’1 ou 2 colonies évocatrices au sein d’une flore commensale importante, fonction de l’expérience de la technicienne  Attention aux milieux sélectifs (pyo et cétrimide)

Détection de souches de P. aeruginosa atypiques P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (5) Détection de souches de P. aeruginosa atypiques

Une souche de primo-colonisation Années mut. mut. Une multitude de descendants de phénotypes / génotypes différents (avec tendance hyper-adaptation micro-environnement bronchique et apparition variants atypiques)

P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (2) - Existence dans le biofilm des plusieurs « souches ou populations » différentes de P. aeruginosa (co-infection initiale, surinfection, ou évolution phylogénétique d’une seule souche en différentes sous populations). Tous les morphotypes ne cultivent pas à la même vitesse!  Détection « aléatoire » des souches à croissance plus lente

P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (3)  Patient D.E. : CR itératifs mensuels: - soit 3 P. aeruginosa (tous imipénème S) - soit 4 P. aeruginosa (dont 1 imipénème R)

PROBLEMES DE NUMERATION BACTERIENNE Difficultés d’homogénéisation des prélèvements reproductibilité de la numération probablement médiocre Interactions de flores, problèmes de milieux sélectifs Type de prélèvement seuils décrits pour les expectorations spontanées : quid des écouvillonnages pharyngés, des aspirations NP?

Homogénéisation du prélèvement: problèmes de numération. Méthode classique: - S.aureus 104/ml - P. aeruginosa multi-S 103/ml  Ensemencement à l’écouvillon du prélèvement brut pour CMIs directes: - S.aureus 104/ml - P. aeruginosa multi-S au moins 106/ml - P. aeruginosa n°2 (R tobra et cipro) au moins 106/ml Numération : attention aux milieux sélectifs !!!

PROBLEMES DE NUMERATION BACTERIENNE Difficultés d’homogénéisation des prélèvements reproductibilité de la numération probablement médiocre Interactions de flores, problèmes de milieux sélectifs Type de prélèvement seuils décrits pour les expectorations spontanées : quid des écouvillonnages pharyngés, des aspirations NP?

PROBLEMES DE NUMERATION BACTERIENNE Difficultés d’homogénéisation des prélèvements reproductibilité de la numération probablement médiocre Interactions de flores, problèmes de milieux sélectifs Type de prélèvement seuils décrits pour les expectorations spontanées : quid des écouvillonnages pharyngés, des aspirations NP?

Durée d’observation : 72h DELAI DE DETECTION Durée d’observation : 72h Bactéries à croissance lente : P. aeruginosa mucoïde, B. cepacia D’où délai d’obtention des résultats pour le clinicien

COMMENT AMELIORER LA SENSIBILITE DE L’EXAMEN BACTERIOLOGIQUE? PERSPECTIVES Détection moléculaire? Sérologies ? Détection des bactéries multi-résistantes par ensemencement direct du prélèvement sur boîtes avec disques d’ATB ou bandelettes E-test?

P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (1)  Patient D.E. : CR itératifs mensuels: - 3 P. aeruginosa (tous imipénème S)

Ensemencement direct d’une gélose pour ATBG P. aeruginosa et mucoviscidose: problèmes de détection des souches (2) Ensemencement direct d’une gélose pour ATBG  même patient  4ème souche, imipénème R « Gomme » les problèmes d’hétérogénéité des prélèvements  Permet la détection de souches ou sous populations non détectées par la méthode classique

S. aureus meti-R Méthode classique: - S.aureus 107/ml (R peni, S au reste) - autres germes, dont P. aeruginosa  Ensemencement à l’écouvillon du prélèvement brut pour ATBG direct: - S.aureus n°2 (104/ml?) meti-R

Stenotrophomonas maltophilia (et exemple d’interaction de flore) Donc, globalement:  moindre sensibilité aux problèmes d’homogénéisation  meilleure détection de sous populations ou souches résistantes  vision plus réaliste de la sensibilité des germes dans leur environnement bronchique?

P. aeruginosa et mucoviscidose: difficultés d’identification  Classiquement basée sur quelques éléments clés, tous potentiellement pris en défaut dans la mucoviscidose - Morphologie des colonies - Morphologie au Gram - Réaction de l’oxydase - Pigments vert, jaune ou bleu - profils biochimiques en galerie (délai d’incubation…) - ATBG  Identification moléculaire (sequençage 16S et/ou recA, + 72h)

SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES

Difficulté lecture des ATBG (1)

Difficulté lecture des ATBG (1)

P. aeruginosa : ATBG sur chaque morphotype ?

P. aeruginosa : ATBG global ?

P. aeruginosa : ATBG direct ?

Pseudomonas aeruginosa : résistance aux antibiotiques (1)  Résistances naturelles Pyo E. coli  mais aussi quinolones, ceftriaxone, tetracyclines, chloramphenicol, cotrimoxazole...

Pseudomonas aeruginosa : résistance aux antibiotiques (2)  phénotype « sauvage »

Pseudomonas aeruginosa : résistance aux antibiotiques (3)  De nombreux mécanismes de résistances  Pénicillinases (TEM, PSE, OXA…)  dérépression céphalosporinase  Bétalactamase à spectre étendu (BLSE)  carbapénèmases  inactivation enzymatique des aminosides  mutations gènes topo-isomérases imperméabilité membranaire (globale ou porine D2)  systèmes d’efflux…  combinaisons de tous ces mécanismes!!!  mécanismes imparfaitement élucidés de résistance et de tolérance aux ATBs in vivo liés au mode de croissance en biofilm

P. aeruginosa et mucoviscidose: multirésistance aux antibiotiques - Le biofilm constitué est virtuellement impossible à éradiquer. - plus le temps de contact entre une bactérie vivante et un ATB est long, plus le risque sélection Rce est important.  Quelles molécules choisir? Selon quels critères? - choix empirique - résultats des cures précédentes - tests in vitro complémentaires?

Pseudomonas aeruginosa : résistance aux antibiotiques (4)  Quelques particularités  tobramycine ATBG classique : résistance dés que CMI > 8 mg/L hors TOBI  600-1000 mg/L dans sécrétions bronchiques  Nécessité mesure CMI E-test (bandelettes fortement chargées (jusqu ’à 1024 mg/L)  Imipénème/ méropénème (attention aux faux IPM intermédiaires, CMI méro svt un peu meilleures que IPM)  Céfépime : Pyo svt modérément sensible, mais parfois (rarement) moins touchée que CAZ par la résistance Témocilline : gain surtout chez B. cepacia, moins évident chez pyo colistine : nécessité CMI

P. aeruginosa et mucoviscidose: tests in vitro d’associations antibiotiques CMI cipro : > 32 mg/L (Résistant) CMI ceftaz : 64 mg/L CMI cipro + ceftaz : 0.75 mg/L (Sensible)  Résultats à priori imprévisibles : nécessité de tester systématiquement

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo - La présence d’un biofilm est l’un des éléments responsables de la mauvaise corrélation entre sensibilité in vitro aux ATB et sensibilité in vivo!  Quels facteurs peuvent expliquer ces discordances? Quelles solutions proposer?

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (2)  A t’on bien détecter toutes les souches présentes dans le sputum  cure à base d’imipénème, résultat clinique jugé insuffisant : mauvaise corrélation in vitro/in vivo!?  Présence d’une 4ème souche de P. aeruginosa (imipénème R) pouvant expliquer le résultat clinique médiocre

? Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (5)  Effet inoculum ?  Propriétés physicochimiques du sputum  Interactions de flores  Comment prendre en compte tous ces phénomènes?

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (3)  Souches mucoides, biofilm bactériens  Les souches mucoides multi-sensibles in vitro, mais difficiles à éradiquer in vivo!  Aptitude particulière à croître en biofilm

Pseudomonas aeruginosa et biofilm Understanding bacterial biofilms in patients with cystic fibrosis: current and innovative approaches to potential therapies. J Cyst Fibros. 2002 Biofilm = croiss en microcolonies adhérentes, entourées d ’une matrice polysaccharidique. Croissance en biofilm = fact virulence permettant persistance de l’infection, notamment face au syst immunitaire et aux ATBs

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (4)  Le biofilm bactérien  Matrice extracellaire très abondante - adhésion+++ - protection contre phagocytose - pénétration difficile des ATBs???  métabolisme ralenti, pptés physico-chim, anaérobiose relative  Tests in vitro classiques: culture phase libre et non Biofilm  Bactéries plus résistantes en mode biofilm (Aaron et al., JCM 2002) ex : CMI ceftazidime 8  256 (culture libre  biofilm) CMI méropénème 1  16, CMB 128 !

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (6)  « Antibiogramme » directement à partir du sputum  Détection aisée des souches les plus résistantes (si densité suffisante)

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (7)  « Antibiogramme » directement à partir du sputum

Tests de sensibilité aux antibiotiques : corrélation in vitro/in vivo (8)  CMIs directement à partir du sputum  CMI directement sur prélèvement : >32  CMI méthode classique : 2 mg/L  Méthode permettant prise en compte - propriétés physicochimiques du sputum - inoculum « réel » - toutes souches et sous populations (si densité suffisante) - état biofilm - interactions de flore (streptocoques oraux)  Mais : - méthode complémentaire démarche classique - Signification clinique peu ou pas connue à l’heure actuelle - rares travaux publiés (Serisier et al., Pediatr Pulm 2003)

Mauvaise corrélation in vitro / in vivo : un isolat résistant n’est pas forcément très pathogène !

ANALYSE BACTERIOLOGIQUE DES SECRETIONS BRONCHOPULMONAIRES DU PATIENT ATTEINT DE MUCOVISCIDOSE Pourquoi prélever ? (primocolonisation, suivi Rces) Pourquoi c’est long ? (délai croissance, identification, tests ATB) Pourquoi c’est difficile ? (phénotypes infections chroniques, bactéries rares) Pourquoi une reproductibilité douteuse ? (détection, numération, tests ATB) Pourquoi manque corrélation in vitro / in vivo tests ATB ? (biofilm, nbeux clones différents sans corrélation pathogénicité / résistance) La bactériologie n’est pas une science exacte, surtout ds le cadre de la mucoviscidose  Tout résultat surprenant doit être rediscuté entre clinicien et bactériologiste