Diagnostic et Suivi biologique de l’infection par le VIH Professeur Lassana SANGARE UFR-SDS, Université de Ouagadougou 9è Session du DIU "Prise en Charge Globale des Personnes vivant avec le VIH en Afrique Sub-saharienne. Ouagadougou, Burkina Faso: 28 mai au 23 juin 2012

Diagnostic de l’infection à VIH

OBJECTIFS (1/2) Citer les marqueurs virologiques de l’infection à VIH Expliquer les courbes d’évolution des marqueurs du VIH chez le sujet adulte infecté Citer deux produits biologiques permettant la détection des anticorps anti-VIH Citer deux produits biologiques permettant la détermination de la CV chez un patient sous traitement

OBJECTIFS (2/2) Énumérer deux tests de dépistage et un test de confirmation Citer deux techniques permettant le diagnostic précoce chez l’enfant de moins de 18mois Citer deux conditions de demande de test de résistance

Rappels virologiques Classification & Phylogénie Morphologie structure Réplication virale Diversité génétique

Classification Famille: Retroviridae Sous-Famille: Orthoretrovirinae Genre: Lentivirus Espèce: virus de l’immunodeficience humaine type-1 et type2 (VIH-1, VIH-2) Très grande diversité du VIH

Origines des VIH

MORPHOLOGIE-STRUCTURE protéines virales et fonctions gp 120 : GP externe Reconnaissance du CD4 et des corécepteurs Fusion entre l'enveloppe virale gp 41 : GP transmembranaire et la membrane de la cellule p 24 : Protéine interne majeure Constituant de la capside p 17 : Protéine de matrice Connection entre l'enveloppe et la nucléocapside p 7/9 : Protéines de la nucléocapside Protéines associées à l'ARN p 66/51 :Transcriptase Rétrotranscription de l'ARN inverse en ADN p 32 : Intégrase Intégration du génome viral p 11 : Protéase Clivage des précurseurs gag et env-pol ARN - 2 brins Aucune différence morphologique entre VIH-1 et VIH-2

DIVERSITE DU VIH variants Groupe M, 9 sous-types Sous sous-types A1 à A4 F1, F2 Plus de 50 CRF Groupe O (Outlier) Groupe N Groupe P 8 sous-types (A-H)

DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE DU VIH (1) CRF07-BC CRF03-AB CRF08-BC CRF04-cpx B,F1 B B,A CRF01-AE,B A,C B,C F A,B,CRF03-AB A,C,D,F,G,H,J,K CRF02-AG CRF06-cpx O, N CRF05-DF CRF10-CD CRF11-cpx Bénin C A,D,C Maroc Mali Sénégal Niger Cameroun R.P. Congo Burundi Tanzanie Réunion Malawi Mozambique Bostwana Afrique du sud Égypte Djibouti Éthiopie Côte d ’Ivoire Guinée R.D. Congo Nigeria Gabon R.C.A. Somalie CRF09-cpx Afrique subsaharienne Peeters M. Recombinant HIV Sequences : Their Role in the Global Epidemic in In Human Retroviruses and AIDS 2001; Peeters M et al. AIDS. 2000, 14(suppl 3) : S129-40

DIVERSITÉ DU VIH Antigènes (anticorps)

Implications de la Diversité du VIH Outils diagnostics Choix des tests de diagnostic sérologique Tests de quantification virale (moléculaires) Choix des schémas thérapeutiques (TARV) Conception des vaccins anti-VIH

DIAGNOSTIC DE L’INFECTION A VIH Marqueurs de l’infection à VIH Cinétique/Evolution des marqueurs Définitions opérationnelles Diagnostic direct Diagnostic sérologique

MARQUEURS DE L’INFECTION Virus entier Acides nucléiques Diagnostic direct Antigènes (p24) Anticorps Diagnostic indirect (Sérologique)

Cinétique des marqueurs

Foetus

Cinétique des marqueurs chez grand enfant et adulte non traités par ARV

CINÉTIQUE DES MARQUEURS après prophylaxie ARV chez grand enfant et adulte

Fenêtre sérologique Délai entre la contamination et la date de détection des anticorps anti-VIH Séroconversion 3ème semaine au plus tôt 7ème mois au plus tard 6-8 semaines en moyenne Considérablement réduit avec les nouveaux tests «(3ème et 4ème) générations

Fenêtre sérologique: Réduction selon les générations de tests ELISA 1ère Génération Ag naturels de lysats de virus purifiés Nombreux faux positifs 2ème Génération Ag = Protéines recombinantes ou Peptides synthétiques Réduisent de 10jrs la fenêtre sérologique des tests de 1ère génération 3ème Génération Conjugués d’Ag de VIH marqués Réduisent de 5jrs le délai de détection des Ac anti-vIH par tests de 2ème génération 4ème Génération Détection simultanée Ag de VIH et Ac anti-VIH Détectent l’infection à VIH 5jrs avant l’apparition des 1ers Ac

DIAGNOSTIC DIRECT Prélèvements Détection du virus entier Sang (plasma, fraction lymphocytaires) Taches de sang séché sur papier filtre (DBS) Détection du virus entier Détection des antigènes du VIH Détection des acides nucléiques (ADN proviral, ARN viral)

DIAGNOSTIC DIRECT Isolement du VIH en culture cellulaire Indications: Infections du nouveau-né (<18 mois) Primo-infection Avantages: Méthode de référence = Étalon d’or Caractérisation de la souche virale Inconvénients: longue, coûteuse danger biologique réservée aux laboratoires spécialisés (référence)

Détection de l’antigène p24 (ELISA sandwich) Principe: ELISA avec dissociation acide des Ag/Ac Indications: -Primo-infection -Alternative pour la détermination de la charge virale plasmatique

Détection de l’antigène p24 Inconvénients: disponible pour le VIH-1 seul coût  coût PCR en temps réel Avantages: très sensible/ultra-sensible (Schupbach, Perkin-Elmer) Dissociation des complexes immuns: triton et chaleur Sensibilisation possible du signal de détection par étape supplémentaire Seuil de sensibilité : 2-5 pg/ml 1 pg/ml correspond à 1000-10.000 copies d’ARN VIH réduction de la fenêtre sérologique pas d’appareillage spécifique nécessaire (laveur de plaque et spectro = chaîne ELISA)

Détection des acides nucléiques (ADN proviral; ARN viral) -Si détection d’ARN: conversion en ARN parfois nécessaire -Autres techniques d’amplification des AN

Détection des acides nucléiques de VIH Indications: infection néonatale , sérologie incertaine, difficultés de discrimination entre VIH-1 et VIH-2 infections à VIH-1 des groupes O et N infections mixtes à VIH-1/VIH-2 Avantages: très sensible, très spécifique (qualité des amorces) référence ? Inconvénients: infrastructures , équipement, expérience lourdeur, coût

DIAGNOSTIC INDIRECT Diagnostic indirect = Sérologique Prélèvements Sang (total, sérum, plasma, TSS/DBS) Autres: Salive, urines,… Critères de choix Méthodes d’analyses (Unitaires vs ELISA) Stratégie conventionnelle Stratégies alternatives (OMS)

DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE Prélèvements -SANG -Sang total -Tache de sang séchée (TSS ou DBS) -Plasma -Sérum -SALIVE -AUTRES -Urines,…

Prélèvements salivaires

DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE Principaux critères de choix Objectifs: transfusion et transplantations surveillance diagnostic de l ’infection à VIH Détection de VIH-1 (M, N, O) et VIH-2 Sensibilité et spécificité respectant prévalence du VIH dans pays Tests disponibles Tests de dépistage Tests ELISA Tests rapides, simples ou unitaires Tests de confirmation Stratégies de diagnostic sérologique Stratégie conventionnelle Stratégies alternatives (OMS/ONUSIDA)

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Tests ELISA 4 Générations Principes Indirect Compétition Sandwich Immunocapture Combiné (Ag/Ac) ELISA indirect Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Caractérisques et évolution des tests sérologiques 1ère gen 2nd gen 3ème gen 4ème gen Antigène utilisé protéines et peptides recombinants Lysat viral Elisa indirect indirect sandwich indirect anti-HIV IG détection IgG IgG IgG IgM Anticorps Ag p24 Sensibilité + ++ +++ ++++ Spécificité + +++ Année 1985 1987 1989 1997 33

Tests ELISA Avantages et Inconvénients Sensibilité et spécificité Adaptés aux grandes séries Coût faibles Inconvénients Équipements/Appareillage Personnel technique qualifié Électricité Nombre de tests réduits Avec plasma/sérum Température de conservation: +4°C à+ 8°C

Tests unitaires et tests rapides Principes Agglutination Immunofiltration Flux capillaires sur bandelettes (immunochromatographie) Dot EIA Durée: <30mn (2-5mn, voire 15mn) Origine des Ag: 1ère génération = naturels 2ème génération = protéines recombinantes et/ou peptides synthétiques; tests actuels Sensibilité et spécificité: comparables à celles des ELISA de 2ème génération

Tests rapides utilisés pour l’étude Test 1: Determine™HIV-1/2 (Abbott) Négatif Positif

OraQuick Un système appelé Orasure, est utilisé pour collecter le transsudat muqueux oral, un fluide ayant le niveau de concentration IgG plus élevé. 37

Tests rapides utilisés pour l’étude Test 2: SD Bioline HIV 1/2 3.0 (Standard Diagnostics Inc)

ImmunoCombII BiSpot HIV -1 & 2 (Test discriminant)

Avantages des Tests rapides Avec sérum, plasma, voire sang total, salive Ne nécessitent pas «d’équipements» de laboratoire Conservation: température du laboratoire (20°C-30°C) Individuel Durée: 10-30mn Lecture visuelle Peuvent manquer de sensibilité, en particulier en cas de séroconversion précoce, et aussi de spécificité Certains sont discriminants Aide au diagnostic d’urgence Coût réduit

Inconvénients des Tests rapides Sensibilité « légèrement » inférieure aux nouvelles techniques ELISA (séro-conversions) Peu adaptés aux grandes séries

Tests de dépistage de 4ème génération Détection simultanée des anticorps contre le VIH et de l’antigène p24 Sensibilités (seuil de détection = 65-250 pg/ml d’antigène p24) : inférieures à celles des trousses en immunocapture classiques exclusivement conçues pour détecter l’antigène p24 (seuil<25 pg/ml) Permet de gagner environ 2-5 jours par rapport aux trousses de dépistage des anticorps anti-VIH non combinées Mais même les plus sensibles ne doivent pas remplacer les trousses de détection de l’antigène p24 pour le diagnostic de primo-infection Inversement, une négativité avec un test combiné ne permet pas de rassurer une personne exposée au risque d’infection à VIH

Tests de confirmation sérologique Western blot ou Immunoblot Western blot modifié ou amélioré Tests d’Immunoanalyse en lignes (LIA) Test d’Immunofluorescence indirecte (IFA) Test de Radioimmunoprécipitation (RIPA) Inconvénients (Technique delicate) demande une bonne expérience pour son interprétation, qui demeure subjective fabrication artisanale des lots, ce qui entraîne des charges différentes en protéines, et en particulier en gp160 onéreuse : #15-20 euros

Doubles séropositifs VIH-1 et VIH-2

Séroconversion –Infection à VIH-1

Critères d’interprétation des WB ORGANISATION CRITÈRES Positivité (au minimum) Négativité OMS 2 bandes env Aucune bande CDC 2 bandes parmi les: p24, gp41, gp120/160 CSSR 1 bande p24 ou p32 et 1 bande gp41 ou gp120/160 Croix Rouge Américaine Au moins une bande de gag, pol et env FDA p24, p32, et gp41 ou gp120 -Consortium pour la standardisation de la Sérologie des Rétrovirus -Les profils ne remplissant ni les critères de positivité ni les critères de négativité sont considérés comme « Indéterminés ».

WB VIH-1 indéterminé ? Séroconversion VIH-1? Infection par VIH-2 ? Erreur de tube ? Variant ?

Stratégies de diagnostic sérologique du VIH Conventionnelle Tests de dépistage (ELISA) + Western blot (si ELISA+) Alternative 3 Algorithmes I: II III Equivalente à la conventionnelle

PROBLÉMATIQUE DES SÉROLOGIES INDÉTERMINÉES Importances: +++ Stratégies Conventionnelle (WB et autres tests de confirmation) Alternatives : qualité des tests Résolution Faux positifs (contextes) Diversité du VIH Recours à d’autres techniques

Stratégies de dépistage Recommandations de l’OMS/ONUSIDA pour la détection des Ac anti-VIH

Stratégies de dépistage Recommandations de l’OMS/ONUSIDA pour la détection des Ac anti-VIH

Stratégies de dépistage Recommandations de l’OMS/ONUSIDA pour la détection des Ac anti-VIH

Causes d’erreurs Diversités antigéniques et des virus Causes liés aux tests Causes liées au manipulateur Causes liées à l’échantillon Réponses immunitaires de l’hôte infecté

SUIVI BIOLOGIQUE DE L’INFECTION À VIH

Représention de Coffin (1996)

SUIVI BIOLOGIQUE But Paramètres du suivi Surveillance de l’efficacité du traitement Paramètres du suivi Immunologique (Numération lymphocytes T CD4+) Virologique (CVP) Biochimiques Hématologiques Infections opportunistes

Examens du suivi biologique Analyses Biochimiques Glycémie Azotémie Créatininémie Transaminases Amylasémie CPK PAL Lipasémie Triglycérides Bilirubine Cholestérol

Examens du suivi biologique Examens hématologiques Numération Formule Sanguine (NFS)

Examens du suivi biologique Bilan initial chez Adultes (M0) Sérologie VIH Charge virale plasmatique Numération des lymphocytes T CD4+ Numération formule sanguine Sérologie VHB (AgHBs), VHC, Syphilis Analyses biochimiques Glycémie/Azotémie Créatininémie Transaminases Amylasémie CPK Recherche de KAOP Test immunologique de grossesse (femme)

SUIVI DES PATIENTS (1) Examens du suivi à M1 Efficacité du traitement Numération des lymphocytes T CD4+ Charge virale plasmatique Surveillance de la toxicité des ARV Numération formule sanguine Transaminases Créatininémie Phosphatase alcaline Bilan métabolique Glycémie  Bilan pas obligatoire

SUIVI DES PATIENTS (1) Examens du suivi à M3-M4; tous les 3-4 mois Efficacité du traitement Numération des lymphocytes T CD4+ Charge virale plasmatique Surveillance de la toxicité des ARV Numération formule sanguine Transaminases Créatininémie Phosphatase alcaline, CPK, Lipasémie, Amylasémie Bilirubine Bilan métabolique Glycémie Cholestérol Triglycérides Diagnostic des infections opportunistes

Examens du suivi biologique Bilan initial chez enfants<18mois (M0) Sérologie VIH ? Détection de l’ARN viral par RT-PCR ou Ag p24 (VIH-1) Charge virale plasmatique Numération formule sanguine Glycémie Créatininémie

Examens du suivi biologique Bilan initial chez enfants≥18mois (M0) Sérologie VIH Détection de l’ARN viral par RT-PCR ou Antigène p24 (VIH-1) Charge virale plasmatique Numération formule sanguine Glycémie Créatininémie Transaminases

Examens du suivi biologique Bilan à M1 Efficacité du traitement Numération des lymphocytes T CD4+ Charge virale plasmatique Surveillance de la toxicité des ARV Numération formule sanguine Transaminases Créatininémie Phosphatase alcaline (PAL) Bilan métabolique Glycémie  Bilan pas obligatoire

Examens du suivi biologique Bilan à M3-4 et tous les 3-4mois Efficacité du traitement Numération des lymphocytes T CD4+ Charge virale plasmatique Surveillance de la toxicité des ARV Numération formule sanguine Transaminases, Créatininémie, Bilirubine PAL, CPK, Lipasémie, Amylasémie Bilan métabolique Glycémie Cholestérol Triglycérides Diagnostic des infections opportunistes

Examens du suivi biologique Accidents d’exposition au VIH Évaluation du risque (par clinicien) Sérologie du « patient-source » Bilan initial dans les 0-48heures du blessé (mieux dans les 4 heures) Sérologie VIH AgHBs et Anti-VHC Transaminases

Examens du suivi biologique Accidents d’exposition au VIH Bilan de surveillance Sérologie VIH: 3ème et 6ème mois NFS Transaminases Autres examens si TARV poursuivi

Examens du suivi biologique Examens de diagnostic des IO Examens parasitologiques Examens cytobactériologiques Examens virologiques

MESURE DE CHARGE VIRALE Définition : Détermination de la quantité de virus chez l’individu infecté, dans Sang (sang total sur tube; DBS) tissu lymphoïde Méthodes Dosage des protéines virales Quantification des acides nucléiques

Méthodes de mesure de la CV

Outils de suivi virologique Par dosage des protéines virales Antigène p24 «sensibilisée» Détection de l’activité transcriptase inverse (ExaVir® Version 2, Cavidi Tech) Techniques « alternatives » aux techniques moléculaires de « référence »

Mesure de charge virale de VIH Quantification des protéines virales ExaVir™Load Quantitative HIV1 Load Kit, vr 2 ELISA ultra sensible Innotest™ Manufact. Cavidi Perkin Elmer Innogenetics Principe Seuil -Activité TI ≈400 copies/ml -Ag p24 sensib. ≈50 copies/ml Technique ELISA Cible pol gag Variants M (A-G), O, VIH-2 M (A-G), O Durée 2,5 j 2,3 h 2 h Equipement 12 000 $ 10 000 $ Coût/test 15 $ 10 $

Mesure de charge virale de VIH ExaVir™Load Quantitative HIV-1 Load Avantages Equipement peu onéreux Fonctionne sur tous les sous-types Sensibilité de l’ordre de 400 copies/ml Pas de risque de contamination Inconvénients Longue : 2,5 jours Fastidieuse (étape de capture des particules virales) et série limitée (30 échantillons) Variation inter-essai élevée : 15% Relativement coûteuse Non validée par rapport aux trousses de référence de biologie moléculaire Non connue et non validée en clinique

Tech commerciales standardisées Mesure de charge virale de VIH Quantification des acides nucléiques (biologie moléculaire) Deux principes : Amplification de la cible PCR point final, PCR temps réel Amplification du signal Tech commerciales standardisées RT-PCR ou *RT-PCR en temps réel ADN branché Système « ouvert » ou « fermé » Techniques «maisons» *RT-PCR en temps réel (protocole ANRS AC11) * : Tecnniques dites « alternatives » aux techniques dites de « référence »

Amplification de la cible_PCR quantitative (ADN proviral; ARN viral) -Si détection d’ARN: conversion en ARN parfois nécessaire -Autres techniques d’amplification des AN

Principes de quantification des AN viraux Virus, bactérie ou cellule Cible ARN ou ADN RT-PCR PCR bDNA Ajouter primers & enzymes Ajouter primers & enzymes Ajouter sondes et ADN branché Copies (ADN) Plusieurs sondes de détection par cible Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie 1 sonde de détection par copie amplifiée Cibles Signal

Outils de suivi Virologique Techniques de mesure des AN de VIH Mesure du Signal Quantiplex HIV-1 Vr 3.0 (Bayer/Chiron) Versant HIV-1 RNA 3.0 (Bayer Diagnostics) Mesure de la Cible Amplicor Monitor HIV-1 vr1.5 (Roche) Nuclisens HIV-1 QT Nuclisens Easy Q VIH-1 (Organon/BioMérieux) Abbott HIV-1 Quantitative rtPCR

Outils de suivi Virologique Mesure de l’ARN plasmatique de VIH Test Amplicor Monitor HIV-1 v1.5 (Roche) Nuclisens HIV-1 (Organon/ BioMérieux) Quantiplex HIV-1 Vr3.0 (Bayer/Chiron) Principe RT-PCR NASBA b-DNA Vol. éch 0,5 mL 1-2 mL 1 mL Limite de détection 20 copies/mL 40-80 copies/mL 50 copies/mL Linéarité 50-750.000 copies/mL 80-1.000.000 copies/ml 50-500.000 copies/mL Variants détectés -ss-type B surtout -ss-type A: irrég -ss-type G irrég. groupe M (A-H)

Amplicor Cobas HIV1 Monitor Retina HIV1 Rainbow TROUSSE Versant HIV-1 RNA 3.0 NucliSens HIV-1 QT Amplicor Cobas HIV1 Monitor Retina HIV1 Rainbow Manufact Bayer bioMérieux Roche Primagen Principe ADN branché Real-time NASBA RT-PCR Real-time NASBA Détection Chimioluminescence Electrochimioluminesce Colorimé trie “Molecular beacon fluoresnce” Cible pol gag LTR Variants M (A-G), O M (A-D), O (Pb: G,H) M (A-G) M, N, O Durée 23 h 4-5 h 6-8 h 2 h Equipment 26 000 € 51 000 € 23 500 € 23 000 $ ? Coût/test 25-35 € 15-25 € 17-35 € 25 $ ?

Abbott RealTime HIV-1 Quantitative Assay Pb souches afric. et asiat. PCR en rt PCR ”in-house” Cobas Taqman HIV-1 Abbott RealTime HIV-1 Quantitative Assay Laboratoire ANRS AC11 Roche Abbott Principe RT-PCR temps réel en temps réel Cible LTR gag pol Variants M (A to G) Pb souches afric. et asiat. M (A-G) M (A-G), O, N Durée 4-6 h 4-5 h 5,5h Equipement 35 000 $ 34 000 € 35 000 $ ? Coût par test 10-17 € 17-35 € 40 $ ?

Résultats des mesures de Charges virale Résultats exprimés copies/ml Log/ml Interprétation des résultats : variation biologique: 0. 5 log Modifications transitoires : Infections aiguës (grippe, herpes) Vaccinations

ARN-VIH plasmatique (charge virale ») interprétation des résultats Variabilité de la mesure : -Liée à l'anticoagulant, aux plaquettes; -Liée aux méthodes; -Variabilité intra individuelle 0,2 - 0,3 log = facteur 2 Les valeurs sont comprises entre 1,3 et 7 Variations significatives : > 0,5 log = facteur 3 ACTUALISER C. Tamalet, C. Rouzioux Brun-Vezinet F, Dormont J. Méthodes de mesure de la charge virale VIH-1. Med Sci Flammarion, 196 Rapport Dormont, 11.06.1998 : p. 5-8 2

Intérêts des Charges virales plasmatiques -Inversement proportionnelle au nombre T CD4 + -Pronostic de l’évolution de la maladie -Corrélation avec stade clinique -Marqueur de l ’efficacité des ARV Contraintes : équipements, choix et coûts des kits, infrastructures ...

Numération des lymphocytes T CD4

Outils de suivi immunologique Numération lymphocytes T CD4 Collecte des échantillons de sang Anticoagulant Stabilisateurs de sang Cytométrie de flux Marqueurs monoclonaux Plateforme double Plateforme simple Méthodes Manuelles Lecture Microscopique ELISA

Techniques de numération des lymphocytes T CD4 Cytométrie en flux Plateforme double PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES Fabricant Partec; Becton Dickinson; Coulter Coût instrument 20 000-95 000 $ US Coût/test 3-11 $ US Echantillon Sang total Résultats CD4, CD8 (absolu,%, CD4/CD8); rapport lymphocytaire; cellules B et NK possible Nbre analysé/jr ≤ 250 Avantages Précision pipettage non requise; Analyse d’1 seul tube possible sans pb de CQ; CQE disponibl. Inconvénients Analyseur hémato requis; Erreurs de transcription ou de calcul; Sang frais pour numération absolue

FACSCount (BD) CyFlow (Partec) Techniques de numération des lymphocytes T CD4 Cytométres en flux spécialisés FACSCount (BD) CyFlow (Partec) Syst détect° Fluorocchromes conjug aux AcM anti-CD3, CD4, CD8 Fluorocchromes conjug aux AcM anti-CD4 Echantillon Sang total Résultats CD4, CD8 (absolus, % par rapport aux T; CD4/CD8) CD4 absolu Corrélation avec réf (r) 0,93 – 0,98 (plusieurs études interntles) 0,96 – 0,96 (quelques études) Coût instrumt 25 000 $ US 20 000 $ US Coût/test 6 – 20 $ US 2 $ US Avantages Automatisation; Peu d’étapes; moins d’erreurs humaines; CD4 et CD8 absolus; Rapide; CQE dispo Coût réactifs; Rapide; CQE Inconvénts Coût réactifs; 12 échant à la fois; %CD lymphoctre indispo %CD lymphoctre indispo; Evaluations en cours

BD FACSCount* (Becton Dickinson) Dédié aux lymphocytes T CD4/8/3 Simple à utiliser Lymphocytes CD4 en valeur absolue et pourcentage Réactifs encore onéreux Coût : 25,000 $ >225 appareils en Afrique Politique commerciale active en Afrique Maintenance régionale++

CyFlow Apogee 40, A40 (Amplimed) Point Care Lab Now Etc. Techniques de numération des lymphocytes T CD4 Autres méthodes en cours d’évaluation CyFlow Apogee 40, A40 (Amplimed) Point Care Lab Now Etc.

A40

Point Care (Beckman Coulter)

Guava Easy CD4 System

Techniques de numération des lymphocytes T CD4 Techniques manuelles Cyto-Sphères (Coulter) Dynabeads (Dynal) Instrument Hémocytomètre; Microscope optique Dispositif magnétique; Hémocytomètre; Microscop opt ou à fluores Mode opérat Co,ptage lyphocytes rosettés par microsphères Comptage des lymphocytes immunocapturés Syst détect° Billes latex conjuguées à AcM anti-CD4 Billes magnétiques conj aux AcM anti-CD4 et-CD8 Echantillon Sang total Résultats CD absolu CD4, CD8 (absolus; rapport) Cor avec réf(r) 0,67 – 0,93 0,94 – 0,96 Coût instrumt 2 000 $ US 2 000 – 10 000 $ US Coût/test 4 – 8 $ US 3 – 5 $ US Avantages Simple; Rapide Simple; Rapide; CD4,CD8 absolus Inconvénts ≤10 éch à la fois; Subjectif; %CD4 indispo; CQE indispo

Mesure des lymphocytes T CD4 : Dynabeads Monocyte (CD14) CD4 MAb 2.1m CD14 MAb 0.6m  Cytospheres de blocage des monocytes

Mesure des lymphocytes T CD4 : Dynabeads/Cytospheres Sang total Billes magnétiques anti-CD14 Recueil des cellules non liées dans le surnageant Billes anti-CD4 Agent bloquant anti-CD14 Cytosphères anti-CD4 Dynabeads Cytospheres

TRAxELISA (Innogenetics) Zummune (Znaxis Inc) Techniques de numération des lymphocytes T CD4 Méthodes non commercialisées ou obsolètes Capcellia (Bio-Rad) OPTI-CIM (CIMA, Cuba) TRAxELISA (Innogenetics) Zummune (Znaxis Inc) Dosage de phosphatase immunoalcaline

Taux de CD4 chez l'adulte Valeurs normales: 750-1180/mm3 Perte moyenne/an: 50 à 60/mm3 Rendu en mm3 ou en % >500/ mm3 >29% 200-500/ mm3 14-28% <200/ mm3 <14%

Intérêt de mesure des T CD4+ Statut immunitaire Stade de la maladie Décision de début intervention thérapeutique Ne mesure pas l’activité du virus

Charge virale et LT CD4+ La C. V. en association avec LTCD4+  image complète du statut immunitaire et de l’activité virale à tous les stades de la maladie

TESTS DE RÉSISTANCE DU VIH AUX ARV

3 types de Tests de résistance du VIH aux ARV Tests phénotypiques (biologiques) Tests génotypiques (moléculaires) Recombinaison virale (biologique+ moléculaire)

Génotypage du VIH-1

Détermination de la séquence comparaison avec une séquence de VIH-1 sauvage -Alignement des séquences et repérage des mutations -Interprétation selon algorithme de Stanford -Rendu des résultats: *VIH-1 sensible aux ARV *VIH-1 résistance possible *VIH-1 resistant

Génotype de résistance : Techniques disponibles Tests commerciaux 4 « services » de génotypage Geneseq (Virologic) Genchec (Virco) HIV GenoSure (Labcorp) GenoType Plus (Labcorp) 2 trousses de génotypage (approuvées par la FDA) Trugene (Visible Genetics/Bayer) Viroseq (Applied Biosystem/Abbott) Nombreux protocoles « maisons » Protocole de l’AC11 de l’ANRS (France)

CONCLUSION Dépistage = porte d’entrée de la prise en charge de l’infection par le VIH Diversité du virus  un obstacle majeur au diagnostic et au suivi de l’infection par le VIH Coût des infrastructures, équipements et intrants divers pris en compte par subventions Surveillances géographiques des virus

Merci