Infections Respiratoires Infections communautaires : S.Pneumoniae, Haemophilus Bordetella, Legionella Dr V.LeclercqCHU Nice 2009

Contexte Pneumonie aiguë - pneumopathie communautaire - pneumopathie nosocomiale Abcès pulmonaire Surinfection de bronchite chronique

Prélèvements Expectoration (ECBC) : Difficulté diagnostique : obtenir des prélèvements NON CONTAMINES PAR LA FLORE OROPHARYNGEE La flore commensale risque de masquer les micro- organismes pathogènes responsables d’infections broncho- pulmonaires. Autres: Aspiration trachéale Brossage bronchique Lavage broncho-alvéolaire

Flore commensale

Epidémiologie Principaux agents responsables : -Streptococcus pneumoniae -Haemophilus influenzae -Mycoplasma pneumoniae -Legionella pneumophila -Chlamydiae pneumoniae -Staphylococcus aureus -Bacilles GRAM - : P.aeruginosa, entérobactéries -Bactéries anaérobies -Moraxella catarrhalis Germes atypiques

Analyse bactériologique 1.Examen Direct 2.Cultures 3.Identification 4.Antibiogramme

Examen Direct –Aspect macroscopique –État frais –Coloration de Gram –Autres colorations

Classes selon Bartlett Murray et Washington Classe Cellules épithéliales / champ (X100) Leucocytes / champ (X100) Interprétation 1>25<10 Non ensemencé (contamination salivaire) 2> Non ensemencé (contamination salivaire) 3>25 Significatif >25Significatif 5<10>25Significatif

Parois bactériennes

Membrane externe, LPS Peptidoglycane ++ Acide lipotechoique Acide techoïque Lipoprotéine LPS GRAM -GRAM +

Coloration de GRAM

Coloration de Ziehl Neelsen pour la recherche de Mycobactéries

Bacilles acido-alcoolo-résistants (ziehl)

Legionella en fluorescence

Cultures En fonction de la technique de prélèvement il existe différents seuils significatifs de croissance bactérienne : –Pour le brossage bronchique : 10 3 UFC/ml –Pour le LBA : 10 4 UFC/ml

S.Pneumoniae Haemophilus Bordetella Legionella

S.pneumoniae Pneumocoque Genre streptococcus Diplocoque à Gram positif Capsulé –Cette capsule est responsable de la virulence : empêche la phagocytose par les polynucléaires.

Pouvoir Pathogène Commensal (hôte normal) du rhino-pharynx Pneumopathie franche lobaire aiguë (PFLA) Méningites Pleurésies purulentes Otites et de sinusites

Pouvoir Pathogène Baisse d’immunité générale ou locale : anomalie du tractus respiratoire, intoxication (alcool), troubles circulatoires, malnutrition, splénectomie… Affections loco-régionales : bronchite, trachéo- bronchite,sinusites, otites, conjonctivites, pneumonies franches lobaires aigues( 15-25% bactériémies), pleurésies. 80% des pneumonies bactériennes Affections à distance: péricardites, méningites, péritonites, arthrites. Réactions fibrineuses fréquentes =>cloisonnements (pleuraux- méningés) aggravent le pronostic.

Bactériologie Examen Direct Culture Biochimie Antigènes Sensibilité aux Antibiotiques Traitement

Examen Direct Gram X1000

Diplocoque Gram + capsulé

Gram X1000

Culture –Germe exigent : gélose au sang anaérobiose ou CO2 anaérobie aérotolérant –Colonies lisses transparentes + hémolyse α

Biochimie Oxydase – Catalase – (H2O2  H2O + O) Sensibilité au sel de cuivre : optochine : lyse de la capsule par les sels biliaires

Antigènes Capsule de nature polysaccharidique Pneumotest + : mise en évidence d’antigènes polysaccharidiques capsulaires par technique d’agglutination latex. Pneumocoque non capsulé ne se différencie pas des streptocoques non groupables

Antigènes Antigènes solubles urinaires

Sensibilité aux antibiotiques Résistance naturelle de bas niveau aminosides Apparition de souches résistantes –46% R érythromycine –40% R cotimoxazole 50% souches sensibilité diminuée à la pénicilline –Le mécanisme de résistance est une modification des PLP et touche aussi d’autres bêta-lactamines (amoxicilline et céfotaxime). Transfert de matériel génétique (streptocoques commensaux résistants aux antibiotiques et pneumocoque dans le rhino-pharynx)

La détection de pneumocoques de sensibilité diminuée à la pénicilline G est réalisée avec un disque d’oxacilline 5 mg (OXA-5) selon les critères suivants : –diamètre OXA-5 > 26 mm : souche sensible à la pénicilline G et aux autres b-lactamines. –diamètre OXA-5 < 26 mm : souche de sensibilité diminuée. CMI : –Penicilline G S ≤ 0.06 mg/L R>2 mg/L –Amoxicilline S ≤ 0.5 mg/L R>2 mg/L –Céfotaxime S ≤ 0.5 mg/L R>2 mg/L

Antibiogramme

E-test

Traitement Antibiotique de choix penicilline A (amoxicilline) vérifier la sensibilité Vaccin (23 types polysaccharidiques les plus fréquents) efficacité incomplète –Indication : sujets splénectomisés et âgés –Vaccin heptavalent chez le jeune enfant administré avant 1 an, 3 injections (protection 93%).

Haemophilus Petits bacilles Gram négatif polymorphes (coccobacille) Aéro-anaérobies facultatifs, immobiles Parasites obligatoires Plusieurs espèces: –H. influenzae –H. parainfluenzae –H. aphrophilus –H. aegyptius –H. haemolyticus –H. ducreyi

Habitat – Pouvoir pathogène Muqueuses de animaux à sang chaud Homme 4 écosystèmes : –Pharynx –Bouche –plaque dentaire –appareil urogénital intestin H.influenzae espèce la + impliquée H.parainfluenzae, haemolyticus, paraphrophilus, aphrophilus,haemoglobinophilus, segnis : –commensaux –infections ORL opportunistes (immunodéprimés) –septicémie et endocardite H.ducreyi : affection vénérienne: le chancre mou

Haemophilus influenzae Commensal de l’oropharynx possède une capsule (6 types a-f) Souches capsulées de type b : –95 % des pathologies invasives (enfant <5ans) : –méningites, septicémies, épiglottites, pneumonies, cellulites, arthrites septiques Infections pulmonaires aiguës de l’enfant dues à différents sérotypes (terrains fragilisés) Infections de l’adulte facteurs favorisants: –traumatisme crânien, agammaglobulinémie, cancer, alcoolisme,splénectomie,diabète. –souches pas toujours capsulées

Haemophilus influenzae Autres types capsulaires a c d e f plus rarement impliqués dans infections invasives. Souches non capsulées biotype II ou III pathologies locales (sinusites, otites, poussées de bronchite chronique, surinfection de DDB et mucoviscidose). Infection virale ou tabagisme favorise colonisation=>infection.

Bactériologie Examen Direct Culture Biochimie - Classification Antigènes Sensibilité aux Antibiotiques - Traitement

Examen Direct Gram X1000 : petits BGN polymorphes

Examen Direct

Coloration de Gram d'une aspiration bronchique d'un malade en réanimation médicale (mélange avec S. pneumoniae)

Culture –Germe exigent : V : NAD (Vitaminique) X : Hémine (Inconnu) –Température optimale de croissance 35-37°C

Culture Culture sur gélose chocolat + polyvitex avec bacitracine colonies blanc gris en 24 heurs

Facteurs de croissance Facteur V –Thermolabile: NAD (nicotinamide adénine dinucléotide ) ou coenzyme I ou NADP (NAD phosphate) ou coenzyme II. Coenzymes de déshydrogénase présents dans les globules rouges, tissus animaux et végétaux et la plupart des bactéries Facteur X –Thermostable = hémine (composé contenant du fer dérivé de l’hémoglobine et des enzymes de la chaîne respiratoire(cytochrome, catalase, oxydase)

Milieux de culture Nécessite les facteurs de croissance selon les espèces : X,V ou les 2 Gélose au sang frais ne convient pas : –(V intraglobulaire et NADase) Gélose au sang cuit : –gélose chocolat chauffé à 75°C: X et V partiellement détruit par chauffage –adjonction d’ extrait de levure apporte NAD.

Classification Facteur X Facteur V oxydasecatalaseurèaseindole H. influenzae ++++(+)+ H. haemolyticus ++++(+)v H.parainfluenzae -++V(-) H.paraphrophilus H.segnis H.aphrophilus H.ducreyi

Antigènes La capsule polysaccharidique de certaines souches permet de définir différents sérotypes de a à f type b ou biotype I est le plus fréquent.

Sensibilité aux Antibiotiques - Traitement Bêta-lactamines: –Pénicilline G : Résistance naturelle –Pénicilline A sensible (R acquise par ß-lactamase) : faire céfinase. –Amox + Ac Clav, C2G et C3G sensible Autres –Erythromycine : Résistant –Bactrim : irrégulier Vaccin –Nourrisson entre 3 à 12 mois (3 injection, rappel 1 an)

Antibiogramme

Céfinase

Bordetella Genre Bordetella : –Bordetella pertussis : bacille de Bordet-Gengou agent de la coqueluche –Bordetella parapertussis : coqueluche atténuée –Bordetella bronchiseptica : pathogène pour le porc et chien mais aussi chez l’homme –Bordetella avium : coryza du dindon opportuniste chez l’homme

Prélèvement

Examen Direct Petit coccobacille Gram négatif coloration bipolaire Immobile (sauf avium et bronchiseptica)

Culture - Biochimie –Aérobie stricte –Exigence en nicotinamide, azote et soufre (BGS) –Culture lente 7j –Colonies en gouttelette de mercure et hémolytique –Catalase + –Oxydase + –Non glucidolytique –Viabilité faible en dehors de l’hôte (sauf bronchiseptica)

Diagnostic biologique Diagnostic direct : –Culture de l’aspiration naso –pharyngée incubée pendant 7 jours sensibilité 50-60%. –IF rapide, manque sensibilité et spécificité. –PCR (séquence ADN pertussis). Diagnostic indirect : –Sérologie (2 sérums à 4 semaines d’intervalle) rétrospectif.

Pouvoir pathogène Coqueluche (chant du coq): –Incubation silencieuse : 2-3 semaines –Phase catarrhale : toux sèche : qq jours –Phase d’état : toux nocturne de plus de 14 jours avec quintes et reprise inspiratoire difficile sans fièvre, chant du coq, apnées, accès de cyanose, vomissements après les quintes ou encore hyperlymphocytose: 1 mois –Phase de convalescence plusieurs mois.

Traitement - Prévention Hospitalisation enfant <1 an (complication) Erythromycine réduit la sévérité si appliqué en début de maladie Isolement du patient (5-7jours) début du traitement Vaccins –Germes entiers tués –forme isolée (Vaxicoq®) ou combinée à d'autres (DTCOQ®, DTCP®, Tétracoq® ou pentavalent incluant le vaccin contre Haemophilus influenzae : Pentacoq® ou Pent-HIBest®)

Legionella

Habitat Bactérie hydro tellurique : –lacs, rivières, –sols humides Multiplication dans les protozoaires libres : amibes (symbiose) - Température optimale °C Réservoirs artificiels: –Tour Aéro-Réfrigérante +++, –Climatisations –Thermes, saunas –Fontaines, nébuliseurs…

Legionella Bacilles à Gram négatif 46 espèces et 64 sérogroupes 0.5 à 5% des pneumopathies communautaires L. pneumophila. 95% des cas, 80% Lp1 Maladie à déclaration obligatoire. Transmission : inhalation uniquement

Pouvoir pathogène : Legionellose Pneumonie aiguë Incubation de 2 à 10 jours Syndrome pseudogrippal (fièvre, toux sèche, céphalées, myalgies, anorexie) Phase d’état (fièvre élevée, dyspnée, toux importante ± expectorations) Pic : été et automne 1 cas / habitants/an Mortalité 20%

La contamination : inhalation d’eau contaminée diffusée en aérosol Ces aérosols atteignent les alvéoles pulmonaires (1) Les légionelles infestent les macrophages alvéolaires (2) Survivent et se multiplient dans les phagosomes à pH neutre (3 - 4). L’inhibition de la fusion du phagosome et des vacuoles lysosomiales permet la survie intracellulaire des légionelles et entraîne la destruction des macrophages (5). Il n'y a pas de transmission inter-humaine.

Quand demander un diagnostic bactériologique ? Pneumonie avec : –Absence d’amélioration sous traitement par ß-lactamine. –Patient présentant un terrain favorisant. –Situation épidémique. –Pneumonie nosocomiale (systématique). –Voyageurs. –Exposition professionnelle à l’eau. Bien préciser au biologiste : Recherche de Legionella

Bactériologie Direct –I.F directe sur le prélèvement –Antigène urinaire –Culture –PCR Indirect –Sérodiagnostic

IF Directe Rapide (2 heures) AC poly et monoclonaux Sensibilité (25-40%) Spécificité (60-70%) Réactions croisées Lecteur dépendant

AG Solubles Urinaires Précoce : 1 à 3 jours Persistance : 45 jours (même si ATB) ELISA 15 minutes Immunochromatographie Sensibilité 80% Spécificité 99% VPN 95% VPP 86%

Culture Méthode de référence (Spécificité 100%, Sensibilité 40-60%) Culture lente 3-10 jours Bactérie exigeante : –Milieu BCYE : exigence en cystéine – fer – charbon (Buffered Charcoal Yeast Extract) –Aérobie stricte CO2 (2.5%) primo isolement –PH tolère pH 5.5 –Température 35°C

Culture Colonies grises muqueuses polymorphes en verre fritté ( loupe binoculaire 30 fois )

PCR Prélèvements –Urines, LBA,sérums Gènes amplifiés –Mip (détection de 50 UFC dans LBA) –Gène rrf correspondant à ARN5s ribosomal (genre Legionella) –ARN16s Avantages: rapidité et détection de toutes les espèces de legionella

Sérologie La technique d'immunofluorescence indirecte (IFI) ou ELISA. Les immunoglobulines totales sont détectées (IgM, IgG et IgA). Augmentation du titre des anticorps (de 4 fois) permet de confirmer le diagnostic de légionellose. Les inconvénients du sérodiagnostic : –tardif voire rétrospectif. –réactions croisées en IFI

Définitions Cas confirmé = Pneumopathie et/ou image radiologique + –Isolement de Legionella. –Immunofluorescence directe positive. –Présence d ’antigènes solubles urinaires. –Séroconversion. Cas groupés = –2 cas survenus en moins de 6 mois dans un même lieu d’exposition.

Sensibilité aux ATB - traitement Legionella : –intracellulaire antibiogramme non recommandé Antibiotiques efficaces : –Macrolides –Fluoroquinolones –Tétracyclines –Rifampicine Prévention : surveillance environnementale et clinique. –entretien régulier des réseaux –circulation permanente de l'eau –Température suffisante de l'eau (> 50°C)