Réactions d’immunoprécipitation Équipe pédagogique du lycée Jean MOULIN (ANGERS) GRELIER – DURAND - POCHET

Définition + Ac précipitants spécifiques  Ag solubles + Ac précipitants spécifiques  Formation de complexes immuns  Conditions optimales : Antigène multivalent Anticorps spécifique Rapport de concentration optimum : équivalence Conditions physicochimiques adaptées (pH, force ionique …)  Formation d’un réseau tridimensionnel Précipité : insoluble, visible Réaction mettant en présence des antigènes solubles et des anticorps spécifiques précipitants et caractérisée par l’apparition d’un réseau d’immuns complexes formant des précipités d’antigènes reliés par les anticorps, visibles à l’œil nu sous forme une opacité (anneau, arc, disque …) dans des conditions optimales : (antigène multivalent, rapport de concentration optimum : équivalence, conditions physicochimiques adaptées (pH, force ionique …))

Phénomène de zone : mise en évidence Expérience de précipitation quantitative Introduction dans une série de tubes d’une quantité fixe d’anticorps Ajout des quantités croissantes d’antigène sous un volume constant Observations de l’apparition d’un précipité Augmentant avec la quantité ajoutée d’antigène Diminuant avec les fortes concentrations d’antigène Lavage des précipités centrifugés et décantés et dosage de l’azote donnant une notion quantitative Quantité fixe d’anticorps dans chaque tube Apparition d’un précipité : augmentant avec la quantité ajoutée d’antigène diminuant avec les fortes concentrations d’antigène Ajout de quantités croissantes d’antigène sous un volume constant

Sur les surnageants de l’expérience précédente Phénomène de zone : mise en évidence Expérience de précipitation quantitative Sur les surnageants de l’expérience précédente 1 : ajout d’Ac 1’ : ajout d’Ag Séparation des surnageants en deux moitiés Sur l’une, ajout d’antigène : si nouvelle précipitation, il restait des anticorps libres dans le précipité Sur l’autre , ajout d’anticorps : si nouvelle précipitation, il restait des antigènes libres Définition de trois zones : Excès d’anticorps Équivalence Excès d’antigènes 1 1’ 2 2’ 3 3’ 4 4’ 5 5’ Excès d’anticorps Équivalence Excès d’antigène

Phénomène de zone : base théorique Quantité de précipité Zone d’excès d’Ag : formation de quelques immuns complexes solubles Zone d’excès d’Ac : formation de quelques immuns complexes solubles Concentration de l’antigène Zone d’équivalence : association des immuns complexes  réseau insoluble précipitant

Phénomène de zone : variations en fonction de la nature de l’Ag Excès d’Ac Excès d’Ag Courbe verte : antigènes protéiques  phénomène de zone marqué  zone d’équivalence étroite Courbes rose et noire : antigènes polysaccharidiques  phénomène de zone très atténué

Réactions de précipitation en milieu gélifié Réaction au sein d’un gel transparent (0,5 à 1% d’agarose purifié) Diffusion des Ag et/ou Ac à partir d’un puits : formation de gradients de concentrations continus Pas de diffusion des complexes immuns : précipitation du réseau Lecture : Directe par apparition de zones de précipitations opaques (arcs, cercles…) Indirecte après lavage et coloration Réaction au sein d’un gel (Types de gels Agar agar = polyosides extraits d’algues utilisés à 0,5 – 1 % d’agarose purifié pour obtenir des gels transparents) = milieu semi liquide composé d’une phase liquide dispersée et dans une phase solide en réseau de mailles Techniques permettant la diffusion des molécules réalisant des gradients continus de concentrations à partir du dépôt mais pas la diffusion des complexes qui s’immobilisent et peuvent précipiter Lecture Directe par apparition de zones de précipitations opaques (arcs, cercles) Indirecte après lavage et coloration

Classification des réactions de précipitation en milieu gélifié Diffusion double (qualitative) Diffusion simple (quantitative) Localisation des Ac diffusant à partir d’un puits présents dans le gel Localisation des Ag Diffusion non accélérée Ouchterlony Mancini Diffusion accélérée électriquement Electrosynérèse Laurell Généralités (suite) Lecture Directe par apparition de zones de précipitations opaques (arcs, cercles) Indirecte après lavage et coloration Classification Diffusion simple : un seul des constituants diffuse l’autre étant incorporé dans la gélose Unidimensionnelle : la diffusion ne peut avoir lieu que dans une dimension Bidimensionnelle : la diffusion s’effectue dans deux directions Diffusion double : les deux constituants diffusent à partir de deux réservoirs distincts Dans les deux cas, il y a possibilité d’accélération de la diffusion par passage d’un courant électrique qui permet la migration différentielle des molécules chargées selon un pH de tampon choisi, les techniques prennent alors le nom d’électroimmunodiffusion.

Technique d’Ouchterlony Immunodiffusion double non accélérée Dépôts des différents antigènes et anticorps dans les puits creusés à proximité dans une gélose. Diffusion radiale des différents constituants durant 48 heures. Formation d’arcs de précipités lorsque des systèmes d’immuns complexes se forment dans des conditions optimales. Utilisation de cette technique dans la recherche de parentés antigéniques Identité partielle Identité complète Non identité

Electrosynérèse Immunodiffusion double accélérée par un champ électrique Installation du gel dans une cuve d’électrophorèse Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration rapide des antigènes vers l’anode des anticorps vers la cathode. Formation d’un arc de précipitation à l’équivalence. Sens des électrons Ac Ag + - Dépôts des antigènes et anticorps dans les puits creusés dans un gel d’agarose Passage d’un champ électrique véhiculé par un tampon pour accélération de la diffusion des deux composés l’un vers l’autre Choix du pH du tampon pour que : l’antigène soit chargé négativement et migre vers l’anode. l’anticorps soit neutre ou légèrement chargé négativement et migre vers la cathode grâce au courant d’électro-endosmose. Formation d’une ligne de précipitation entre les deux puits. Technique également appelée électrophorèse croisée ou contre immuno-électrophorèse : accélérant la technique d’Ouchterlony (30 à 90 min), plus sensible que cette dernière par augmentation de la concentration de réactifs dans la zone de précipitation, pouvant être réalisée sur plusieurs dilutions d’un antigène connu et donner ainsi une évaluation semi quantitative selon la distance de migration du puits. Ac Ag Ac Ag1/2 Ag1/4 Ac + - Sens des électrons

Electrosynérèse : mobilité électrophorétique pH tampon < pHi  protéines chargées + pH tampon > pHi  protéines chargées - Charge + pHi Dépôts des antigènes et anticorps dans les puits creusés dans un gel d’agarose Passage d’un champ électrique véhiculé par un tampon pour accélération de la diffusion des deux composés l’un vers l’autre Choix du pH du tampon pour que : l’antigène soit chargé négativement et migre vers l’anode. l’anticorps soit neutre ou légèrement chargé négativement et migre vers la cathode grâce au courant d’électro-endosmose. Formation d’une ligne de précipitation entre les deux puits. Technique également appelée électrophorèse croisée ou contre immuno-électrophorèse : accélérant la technique d’Ouchterlony (30 à 90 min), plus sensible que cette dernière par augmentation de la concentration de réactifs dans la zone de précipitation, pouvant être réalisée sur plusieurs dilutions d’un antigène connu et donner ainsi une évaluation semi quantitative selon la distance de migration du puits. pH tampon : 8,6  majorité des protéines chargées – (pHi < 8,6)  migration électrophorétique vers l’anode  dépôt de l’antigène côté cathode pH -

Electrosynérèse : mobilité des Ag et des Ac Courant d’électroendosmose : déplacement de cations mobiles et d’eau de l’anode vers la cathode créant un courant d’entraînement s’opposant au courant électrophorétique Antigènes : pHi souvent << 8,6  charges - nombreuses Dépôts des antigènes et anticorps dans les puits creusés dans un gel d’agarose Passage d’un champ électrique véhiculé par un tampon pour accélération de la diffusion des deux composés l’un vers l’autre Choix du pH du tampon pour que : l’antigène soit chargé négativement et migre vers l’anode. l’anticorps soit neutre ou légèrement chargé négativement et migre vers la cathode grâce au courant d’électro-endosmose. Formation d’une ligne de précipitation entre les deux puits. Technique également appelée électrophorèse croisée ou contre immuno-électrophorèse : accélérant la technique d’Ouchterlony (30 à 90 min), plus sensible que cette dernière par augmentation de la concentration de réactifs dans la zone de précipitation, pouvant être réalisée sur plusieurs dilutions d’un antigène connu et donner ainsi une évaluation semi quantitative selon la distance de migration du puits. Mobilité électrophorétique Courant d’electroendosmose Ag + - Mobilités nettes Cathode Anode Ac Anticorps : pHi légèrement < 8,6  charges - limitées

Technique de Mancini Immunodiffusion simple non accélérée Dépôts de différentes solutions connues ou inconnues d’un même Ag dans les puits d’une gélose contenant les Ac spécifiques. Diffusion radiale créant un gradient de concentration de l’antigène avec formation de réseau d’immuns complexes précipitants À l’équivalence. Mesure du diamètre des disques de précipitations. Nécessité d’une gamme d’étalonnage d’antigène permettant de tracer la droite S = a+b [Ag] ou D2 = f [Ag] Utilisation de cette technique dans le dosage de protéines.

Technique de Laurell Immunodiffusion simple accélérée par champ électrique Installation du gel dans une cuve d’électrophorèse Application d’un courant pour accélérer la diffusion naturelle Migration rapide des Ag vers l’anode Formation d’une fusée (rocket) de précipitation à l’équivalence Sens des électrons Ag Ac + - Dépôt des antigènes dans des puits alignés, creusés dans un gel d’agarose tamponné contenant les anticorps spécifiques Application d’un courant électrique perpendiculairement à la ligne des puits ( placée du côté cathode) Migration accélérée des antigènes chargés négativement au pH du tampon dans le gel contenant les anticorps pratiquement immobiles vers l’anode. Obtention de lignes de précipitation ressemblant à des fusées dont la hauteur est fonction de la quantité d’antigène. Nécessité d’une gamme d’étalonnage pour réaliser un dosage quantitatif et tracer une courbe h = f([CAg]) (ou en linéaire logh = f(log([CAg]). Technique accélérant la technique de Mancini (30 à 90 min) plus sensible et plus précise Ac Ag 1/2 Ag h (hauteur des rockets en mm) Ag1/4 - + Sens des électrons

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.1 – Précipitation en milieu liquide 2.1.1 – Test de l’anneau Technique qualitative Superposition des deux solutions Ag et Ac Apparition d’un anneau à l’interface à superposer dans un capillaire de verre sans les mélanger deux solutions de concentrations optimales en anticorps spécifiques antigènes solubles à observer, à l’interface, l’apparition d’un disque de précipitation contenant les immuns complexes précipités Exemples : Classification de Lancefield des streptocoques Solution d’anticorps Apparition d’un anneau de précipitation à l’interface des deux solutions Solution d’antigène

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations Rayons lumineux focalisés Source lumineuse 2.1 – Précipitation en milieu liquide 2.1.2 – Immunonéphélémétrie Technique quantitative Traversée du mélange par un faisceau lumineux monochromatique de haute intensité Mesure de la diffraction de la lumière provoquée par les immuns complexes Technique quantitative à faire traverser, par un faisceau lumineux monochromatique de haute intensité, le mélange anticorps spécifiques antigènes solubles à mesurer à l’aide de capteurs électroniques la diffraction de la lumière réalisée par les immuns complexes Exemples : dosage de nombreux composés (protéines sériques) Solution antigénique + Solution d’anticorps spécifiques Rayons lumineux diffractés Capteur

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.1 – Précipitation en milieu liquide 2.1.2 – Immunoturbidimétrie Technique quantitative Traversée du mélange par un faisceau lumineux Mesure, au spectrophotomètre, de l’absorbance de la lumière par les immuns complexes (lumière absorbée et transmise) Mesure de la lumière diffractée = Néphélémétrie Récapitulatif Mesure de la lumière transmise = Turbidimétrie

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.2 – Précipitation en milieu gélifié 2.2.2.1 – Immunodiffusion simple unidimentionnelle : Technique en tube de OUDIN Utilisation de cette technique dans la recherche de la présence de plusieurs antigènes dans une solution plusieurs disques pourront être observés si plusieurs anticorps spécifiques dans l’immun sérum Gradient de concentration de l’antigène Dépôt de l’antigène Hauteur entre l’interface et le précipité définie par : H = k x log [Ag] x √t Gel contenant l’anticorps Zone d’équivalence

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 1 - Séparation électrophorétique des antigènes déposés dans un puits creusé dans un gel d’agarose Dépôt des antigènes dans les puits + + Gel d’agarose - Séparation électrophorétique

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 2 - Dépôt des anticorps dans une gouttière creusée parallèlement au trajet de migration Dépôt des anticorps dans la gouttière

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : principe 3 - Diffusion double créant des arcs de précipitation correspondant aux réseaux d’immuns complexes colorés pour une meilleure visualisation Diffusion double durant 24 heures

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3.2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse (IEE) : résultats 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Préalbumine (0,28-0,35) Albumine (35-45) Orosomucoïde (0,75-1) α1 antitrypsine (2-5) α 1 antichymotrypsine (α1 lipoprotéine)(2-3) OC globuline Haptoglobine (0,3-2) Céruléoplasmine (0,25-0,4) Alpha2macroglobuline (2,2-2,8) Hémopexine (0,8-1) Transferrine (2-3) βlipoprotéine β C/A complément (0,35) IgA (1-3) IgM (0,7-1,7) β glycoprotéine 1 IgG (8-15)

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3.2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunoélectrophorèse : exemples Résultat normal Augmentation de l’arc avec les anti-IgG Augmentation de l’arc avec les anti-kappa

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3.2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunofixation : principe et résultat 1 - Séparation électrophorétique des antigènes déposés sur une « piste » de gélose Résultat d’un cas identique à l’IEE 2 – Dépôt des anticorps sur la piste de migration : précipitation des IC 3 – Lavages : élimination des Ag non précipités 4 – Coloration des précipités d’immuns complexes formés formant des bandes étroites

Réactions de précipitation Différentes réactions de précipitations 3.2.2.3 - Immunoélectrodiffusion Immunofixation : principe et résultat Résultat d’un cas identique à l’IEE Avantages rapidité d’exécution (2 heures) facilité de lecture (bandes bien nettes et non arcs très fins) Inconvénient autant de dépôts qu’il y a d’anticorps à tester