HIV: diagnostic virologique et suivi des patients infectés Cours D

Diagnostic Indirect = Détection d’Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA - Western-blot « Dater l’infection » Infection récente « Déjà vu le virus » Statut sérologique Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome Culture cellulaire - Immunofluorescence - Technique ELISA PCR RT-PCR

 Techniques  Diagnostic virologique d’une infection VIH chez l’adulte  Suivi virologique d’un sujet infecté par le VIH DIAGNOSTIC ET SUIVI VIROLOGIQUES HIV

Les techniques 1) Techniques de diagnostic indirect  Techniques de recherche des anticorps anti VIH  Tests de dépistage : techniques ELISA  Tests rapides  Tests de confirmation: test sur bandelette (Western blot ou test apparenté) 2) Techniques de diagnostic direct  Techniques permettant la mise en évidence du virus lui-même:  Antigénémie P24  ARN plasmatique  DNA proviral  Tests de résistance du virus aux ARV: technique de séquençage

Principe général de l’ELISA plaque antigène AC anti VIH AC non spécifique « conjugué » : AC anti Ig humaine Couplé à une enzyme Contact de l’enzyme avec un chromogène : Réaction colorée

Principe de l’ELISA - phase solide revêtue d'antigènes VIH - les anticorps anti-VIH se lient sur les antigènes - révélation par :. des Ac anti-Ig humaines conjugués à une enzyme. puis le substrat chromogène est ajouté si Ac anti-VIH : coloration de la cupule grâce à un chromogène soluble

 1ère : antigène = lysat viral purifié  2ème : antigène = protéines recombinantes ou peptides de synthèse  3ème : antigène = idem 2ème génération révélation : antigène conjugué à une enzyme ELISA de type « sandwich »  4ème : détection à la fois des AC et de l’Ag p24 Différentes générations de tests ELISA pour le dépistage VIH

Test de dépistage VIH = technique ELISA Tests ELISA de 4ème génération: Caractéristiques:  Tests mixtes = HIV1 et HIV2  Tests combinés = détectent  les AC  et en même temps l’antigène p24

Tests rapides Test immunochromatographique:  Antigènes recombinants et peptides de synthèse immobilisés sur une membrane  Dépôt du sérum contenant éventuellement des AC spécifiques  Migration du sérum jusqu’aux AG immobilisés  Liaison des AC avec les Ag donnant une coloration visible à l’œil nu  Moins sensibles que l’ ELISA  Détection des AC anti VIH1 et 2 (pas de détection de l’Ag p24)

Tests rapides Test Détermine Négatif Positif Bande témoin de la réaction Bande HIV

Test de confirmation Confirme la spécificité antigénique des anticorps détectés en ELISA Le test utilisé classiquement est le Western Blot On peut également utiliser un immunoblot avec des protéines recombinantes et des peptides synthétiques Bandelette de nitrocellulose sur laquelle les principaux antigènes viraux sont séparés et disposés en bande Lorsque les AC correspondants sont présents dans le sérum: réaction Ag/Ac et visualisation de la bande Des critères de positivité ont été définis (OMS)

Profil western blot GP 160 GP 120 P 68 P 55 GP41 P 40 P 34 P 25 P 18

Western Blot HIV2 HIV1

Test de confirmation pouvant remplacer le Western Blot

Test confirmation pouvant remplacer le Western Blot Bandes spécifiques du VIH1 Bandes spécifiques du VIH2 Bandes témoins de la réaction

Techniques de mise en évidence du virus  Antigénémie P24  Quantification de l’ARN VIH plasmatique = charge virale plasmatique  Recherche (quantification) du DNA proviral

Différents états du VIH Virus intégré Réplication Recherche qualitative:  DNA proviral Quantification  DNA proviral quantitatif CV plasmatique  Quantification de l’ARN plasmatique (PCR quantitative) Virus plasmatique + Ag soluble  Ag p24

Antigénémie P24  L'antigénémie P24 constitue un marqueur de réplication virale  Elle détecte les antigènes solubles produits en même temps que les particules virales lors de la réplication virale  La technique est un test ELISA qui met en évidence les antigènes HIV présents dans le sang

Charge virale  Dans le sang, évaluation de la charge virale : cellulaire : quantité de virus dans les cellules mononuclées = réservoir de virus plasmatique : quantité de virus libre dans le plasma = marqueur de réplication  Ces charges virales cellulaires et plasmatiques peuvent être évaluées par : des techniques de culture en dilution limite abandonnées au profit des techniques de biologie moléculaire Basées sur le principe de la PCR

Principe de la PCR  Amplification exponentielle d’un ADN cible  20 à 40 cycles d’amplification  Chaque cycle comprend 3 étapes:  Dénaturation de l’ADN par la chaleur à 95° : séparation des 2 brins  Hybridation avec 2 amorces de 10 à 20 nucléotides encadrant la région à amplifier  Élongation à partir des amorces grâce à une enzyme thermostable agissant à 72°

dNTP Taq polymérase Amorces Tampon Matrice ADN 95°C55°C72°C DénaturationHybridationElongation 30 cycles

Principe de la PCR

PCR – définitions  RT-PCR: la PCR est précédée d’une étape de « réverse transcription »  Formation d’un cDNA  Utilisée dans le cas des virus à ARN  PCR quantitative: permet d’évaluer le nombre de copies de génome viral Quantification à l’aide d’un standard interne PCR en temps réel : technique utilisée le plus souvent actuellement  « nested PCR » ou PCR nichée: consiste à faire suivre une première série de cycles de PCR par une 2° utilisant des amorces situées à l’intérieur du premier fragment amplifié Augmente la sensibilité de la technique

PCR - précautions  Risques de contaminations Problème majeur de ces techniques: contamination par les produits amplifiés d’une manip précédante  Bonnes pratiques +++ : précautions dans les manipulations, pièces dédiées, système Ampérase.  Résultats faussement négatifs: Peuvent être liés à la présence de substances inhibitrices dans les prélèvements  Techniques d’extraction du matériel génétique avant amplification sont capitales

Quantification de l’ARN VIH plasmatique: = Charge Virale plasmatique  Prélèvement de sang sur anticoagulant (EDTA)  Centrifugation pour obtenir le plasma  Extraction de l’ARN des virus présents dans le plasma  RT PCR quantitative: Technique de PCR en temps réel Utilisation d’un standard interne

PCR en temps réel : principe  Mesure en continu des produits de PCR formés à chaque cycle et non en fin de réaction comme dans la PCR classique  Mesure grâce à des sondes fluorescentes hybridées et activées simultanément à l’amplification. Le taux d’amplicons mesuré est proportionnel à la quantité initiale d’acide nucléique. Meilleure reproductibilité et meilleure précision que la PCR quantitative classique Intensité du signal Nombre de cycles Phase exponentielle: lecture à chaque cycle des produits accumulés = PCR temps réel Plateau: Lecture en point final PCR classique

Automatisation de la CV par technique de PCR en temps réel extracteur PCR « temps réel »

Diagnostic virologique d’une infection HIV chez l’adulte

Diagnostic d’infection VIH chez l’adulte  Première étape : dépistage Permet la mise en évidence dans le sang périphérique:  des AC spécifiques dirigés contre les protéines de structure du virus  de l’antigène p24  Deuxième étape : confirmation

Évolution des marqueurs virologiques au cours de la primo-infection Seuil de détection des marqueurs Anticorps ARN plasmatique Antigène P24 Temps en jours J0 (contage) J12J14-15 J20-21

Détection des différents marqueurs virologiques au cours de la primo-infection J0 : contage Fenêtre silencieuse J12-14: ARN plasmatique J15-16: pic d’Ag P24 Dure environ 10 jours J 20-21: AC antiVIH par ELISA 3° génération ou par test rapide J25-26: AC anti VIH par WB temps Tests ELISA 4° génération Charge virale

Algorithme de dépistage d’une infection VIH chez l’adulte Un seul test : ELISA 4ème génération - + Test de confirmation sur le même sérum (Western Blot ou test immunoblot apparenté) Résultat rendu négatif + Contrôle de la sérologie sur un 2ème prélèvement: = Test ELISA 4ème génération Résultat rendu positif Négatif ou indéterminé 2ème prélèvement à 15 jours CV éventuellement

Interprétation du test de confirmation  moins sensible que l’ELISA  reste cependant obligatoire pour le diagnostic  test de confirmation positif: nouveau dépistage sur un 2° prélèvement obligatoire pour affirmer le diagnostic de séropositivité VIH  Test de confirmation indéterminé: plusieurs hypothèses

Test de confirmation indéterminé  Infection par VIH2  Western blot spécifique VIH2  Séroconversion en cours  Ag P24, et surtout actuellement CV  Évolutivité des tests AC sur un 2° prélèvement 15 jours plus tard  Réactivité non spécifique  Seulement après avoir éliminé les autres hypothèses

Règles à respecter pour le dépistage  Test de dépistage est obligatoirement un test ELISA de 4ème génération  Consentement obligatoire  confidentialité absolue  Dépistage obligatoire pour : don de sang, de sperme, de tissu ou d’organe

Utilisation des tests Ag P24 et CV Dans le cas particulier du diagnostic de la primoinfection: Le diagnostic n’est plus uniquement une recherche d’anticorps: > Mise en évidence du virus lui-même  Ag P24:positif 15 à 16 jours après le contage durée du pic d’antigénémie: environ 10 jours valeur prédictive positive très élevée effectuée en même temps que la recherche d’AC dans le test de dépistage  ARN VIH plasmatique (= « charge virale » ) marqueur le plus précoce: 13 à 14 jours après le contage reste souvent positif en l’absence de traitement

Suivi virologique d’un patient infecté par le VIH 2 techniques virologiques sont utilisées en routine pour le suivi des sujets infectés:  Charge virale  Test de résistance génotypique

 Le taux de CD4 + représente:  La distance qui sépare le véhicule du précipice  La charge représente:  La vitesse du véhicule  La réponse immunitaire et le traitement anti- rétroviral représentent:  Les freins Taux de CD Charge virale Patient infecté par VIH

Charge virale plasmatique La charge virale représente:  Un marqueur pronostic  Un marqueur permettant de suivre l’évolution de la maladie  Un marqueur permettant de suivre l’efficacité d’un traitement antirétroviral

Suivi virologique d’un patient infecté par VIH  patient non traité ==> Charge virale tous les 4 à 6 mois si CD4 > 500/mm 3 ==> Charge virale tous les 3 mois si CD4 < 550/mm 3  Mise sous traitement -Test génotypique de résistance - CV initiale  Suivi de l’efficacité du traitement CV 1 mois après le début du traitement puis tous les 3 mois la 1° année Le but est d’obtenir une CV indétectable (<50 copies/ml) au-delà d’un an de TRT: CV tous les 3 à 6 mois selon la clinique et les CD4 Echappement virologique = CV redevient détectable tests de résistance aux ARV (et dosages pharmaco)

Cycle réplicatif et traitements Liaison au récepteur et au corécepteur fusion Rétrotranscription Intégration Transcription épissage Traduction Bourgeonnement Maturation ARN ADN Inhibiteurs de RT Inhibiteurs De protease Inhibiteurs D’entrée Inhibiteurs D’intégrase Réverse Transcriptase Intégrase Protéase  Inhibiteur du corécepteur CCR5  Inhibiteur de fusion  Inhibiteurs nucléosidiques de RT  Inhibiteurs non nucléosidiques de RT

Le VIH a une tendance naturelle à la mutation Multiplicité des cycles de réplication (1 à 10 milliards de particules /jour) + Grande variabilité au cours de la réplication = Variants génétiquement distincts provenant du virus initial contaminant (quasi-espèces)

Phénomène de résistance Lié à des mutations entraînant une diminution de l’affinité de l’enzyme pour son inhibiteur  Préexistence des virus mutés chez les patients non traités Variabilité génétique importante des VIH  taux d’erreur important de la RT lors de la réplication  dynamique élevée de la réplication virale (10 9 particules/jour) --> population existe sous forme de quasi-espèces  Emergence des virus mutés résistants sous la pression de sélection thérapeutique

Pression de sélection Sélection de variants résistants Suppression incomplète Charge virale Temps Variants sensibles Variants résistants Début du traitement V. Calvez

Mesure de la résistance En routine, la mesure de la résistance est effectuée par la mise en évidence des mutations génétiques au niveau des sites d’action des médicaments = Résistance Génotypique Ce test de résistance est pratiqué chez les patients VIH traités et qui ont un échappement au traitement

Tests génotypiques Séquençage des gènes codant pour la RT,la protéase et l’intégrase : Pour les inhibiteurs de RT, Inhibiteurs de protéase, Inhibiteurs d’intégrase Séquençage du gène codant pour la gp 41 Pour les inhibiteurs de fusion Rétrotranscription de l'ARN viral PCR grâce à une enzyme thermostable 2ème PCR Séquençage du fragment PCR avec différent oligonucléotides Séparation des brins synthétisés par chromatographie Lecture de la séquence sur un séquenceur automatique

Séquenceur automatique

Lecture et interprétation des séquences

Tests génotypiques  Comparaison avec la séquence d’une souche de référence non mutée  Mise en évidence des mutations connues pour être associées à la résistance à un médicament  Rendu des résultats pour chaque médicament grâce à des algorithmes d’interprétation des mutations Ces algorithmes sont élaborés d’après les résultats des études cliniques (corrélations mutations/échec au médicament)  Adaptation du traitement anti-rétroviral en fonction des résistances