Plan du cours 1. Introduction 2. L’eau 3. Les acides aminés, les peptides et les protéines 4. La structure tridimensionnelle des protéines 5. Exploration des protéines 6. La fonction des protéines 7. Les enzymes 8. Les glucides 9. Les nucléotides et les acides nucléiques 10. Les technologies de l’ADN 11. Les lipides 12. Les membranes biologiques et le transport 13. La signalisation cellulaire 14. Cancer et apoptose

5. Exploration des protéines 5-1

Dosage des protéines 5.2. Séparation des protéines 5.3. Méthodes immunologiques

Dosage des protéines Introduction Lyse cellulaire (milieu hypotonique) Plasma (tubes avec anticoagulants) Sérum = Plasma – Fibrinogène (tubes secs) Plasma, sérum, lysat (extrait) cellulaire,… Dosage des protéines (UV, méthode du biuret, méthodes de Kjeldahl, de Bradford, de Lowry,…)

Mesure de l’absorbance à 280 nm (UV) Rappel Le tryptophane et la tyrosine absorbent la lumière ultraviolette (280 nm) (voir dias 3-17 à 3-21) Inconvénient: le contenu en Trp et Tyr varie fortement d’une protéine à l’autre

Méthode du biuret Principes Un complexe de coordination se forme dans une solution alcaline entre un cation Cu ++ et les atomes d’azote nucléophiles de 4 molécules de biuret Coloration violette, absorption optimale à 545 nm Molécule de biuret

5-6 Dans les mêmes conditions, les cations Cu ++ forment également des complexes de coordination avec les liens peptidiques. Ne réagit pas avec les autres molécules azotées (ex. urée)! (≠ Kjeldahl) -Cα-C-N-Cα- - H - - O - H - - O - H - - O - H - - O Cu ++ Réactif du biuret: CuSO4, NaOH, tartrate de K-Na (empêche la précipitation d’hydroxyde de cuivre) et KI (empêche l’autoréduction d’hydroxyde de cuivre) + Protéines (échantillon de sérum par ex.) Coloration violette (proportionnelle au nbre de liens peptidiques) Mesure de l’absorbance (545 nm, lumière visible)

Exemples d’hypoprotéinémie et d’hyperprotéinémie Hypoprotéinémie Insuffisance alimentaire Maldigestion, malabsorption Dérégulation de l’anabolisme des protéines Pertes de protéines (rein, appareil digestif, peau (brûlures)) Hyperprotéinémie Inflammation Déshydratation (hyperprotéinémie fausse!)

Dosage des protéines 5.2. Séparation des protéines 5.3. Méthodes immunologiques

Séparation des protéines Introduction Méthodes: Ultracentrifugation Chromatographie Électrophorèse Principes: Séparation en fonction: de la taille, de la forme, de la charge, des propriétés de liaison,…

Électrophorèse L'électrophorèse est une méthode de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique Séparation dans des gels Gel = état de la matière provenant de la formation d’un réseau de particules, intermédiaire entre un solide et un liquide

5-11 Gel de polyacrylamide (le plus fréquemment utilisé)

5-12 v Ez f = Vitesse de migration Force du champ électrique Charge nette de la protéine Coefficient de friction (poids-taille, forme) (viscosité du gel)

5-13 A.Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) (séparation en fonction du poids moléculaire) Sodium dodécyl sulfate (SDS): -détergent -se lie de manière uniforme aux protéines (tout les 2 aa) -donne une charge négative proportionnelle à la longueur et donc au poids de la protéine -annule les interactions faibles et linéarise donc les protéines (dénaturation) -annule donc les effets forme et charge et permet la séparation sur base du poids β-mercaptoéthanol: rompt les ponts disulfure Protéines mises en solution dans du sodium dodécyl sulfate et du β-mercaptoéthanol

5-14 Les protéines sont ensuite séparées sur un gel de polyacrylamide Coloration du gel au bleu de Coomassie (colore les protéines mais pas le gel)

5-15 B. Electrophorèse des protéines sériques (EPS) (biologie clinique) Pas de dénaturation, ni de dissociation des chaînes polypeptidiques (pas de détergent (ni autres agents dénaturants) et pas de β-mercaptoéthanol) Les échantillons de sérum dilués sont déposés sur un gel d’agarose (pas polyacrylamide!) Électrophorèse réalisée à un pH de 8,7 (séparation des protéines en fonction de leur charge mais aussi de leur taille et forme)

5-16 Coloration (Acide bleu) et décoloration du gel + - DO albumine (50 %) (transport des molécules sériques) γ-globulines (anticorps, IgG)    Densitométrie (= spectrophotométrie mais lecture de l’absorbance du gel en mouvement, 595 nm) α- et β-globulines (protéines de l’inflammation (ex.haptoglobine, céruloplasmine, …), + anticorps IgM et IgA) Electrophorégramme

Bovin Cheval L’électrophorégramme varie selon l’espèce

5-18 Précautions L’échantillon ne peut pas être hémolysé! Si tubes avec anticoagulants Fibrinogène de trouve dans la fraction β 2 Bovins (ß 1 ) Chiens (α 2 )

Dosage des protéines 5.2. Séparation des protéines 5.3. Méthodes immunologiques

Méthodes immunologiques Les anticorps Différents types d’anticorps: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE

5-21 Il est possible de produire des anticorps contre n’importe quelle protéine (lapins et souris) Utilité en biochimie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Immunoblot (Western blot) Immunofluorescence indirecte

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Définition Technique immuno-enzymatique permettant de révéler la présence d’anticorps ou d’antigènes selon le substrat choisi Exemples vétérinaires ELISA indirect: anticorps contre le FIV (« SIDA » du chat) ELISA en sandwich: BVD (bovine viral diarrhea, diarrhée virale bovine) Clostridium perfringens (entérite nécrotique de la poule)

5-23 Réaction chromogénique Peroxydase Substrat (incolore) Produit (ex. jaune)

Immunoblot (Western blot) électrophorèse SDS-PAGE (voir dias 5-13 et 5-14) transfert sur membrane de nitrocellulose anticorps primaire, puis anticorps secondaire lié à une enzyme substrat produit coloration (réaction chromogénique) ou émission de lumière

5-25 Exemples d’application Diagnostic Immunoblot Mise en évidence d’une protéine caractéristique de Dirofilaria immitis (maladie des vers du cœur, transmise par des moustiques) chez le chien et le chat Virus de l’hépatite C chez l’homme Hommes et animaux: Maladie de Lyme (Borrelia burgdorferi), Transmission par les tiques, Western blot sur la flagelline (sang)

Immunofluorescence indirecte Principe Coupe dans un organe

5-27 Exemple d’application Epidermolyse bulleuse (maladie autoimmune) (auto-anticorps dirigés contre la membrane basale de l’épiderme) Auto-anticorps (vert, IFI)