Application des Méthodes Moléculaires à l’Etude du Picoplancton Océanique RCC 371 D. Vaulot & F. Partensky Station Biologique de Roscoff CNRS et Université Paris 6, France

Cytométrie en Flux FACS Vantage Laser double faisceau (UV-488 nm) Tri haut débit (>103 cell./sec) Sensibilité accrue ? Pas embarquable

Analyse cytométrique Fluorescence rouge ( Chlorophylle / cell.) Flagellés Coccoïdes Synechococcus Fluorescence rouge ( Chlorophylle / cell.) Billes Prochlorococcus Side Scatter ( Taille)

THEME 1: Diversité et Abondance des Picoeucaryotes

Amplification gène ARNr 18S Hybridation in situ Approche Moléculaire Echantillon naturel < 3 µm Cultures ADN PCR ou PCR quantitative Amplification gène ARNr 18S DGGE Librairie de clones Séquençage gène ARNr 18S Bases de données Analyses Phylogénétiques Sondes moléculaires

Structure ARNr 18S Universel Possède des régions avec de conservation variables ARN ribosomal très abondant Bases de données de séquence très larges Van de Peer et al. 1996

Lignées Eucaryotiques du Plancton Arbre 18S rRNA Entamoeba Acanthareans Dictyostelium discoideum Kinetoplastida Haplosporidia Euglenida Polycystinea Myxomycetes Vahlkampfiidae Foraminifera Perkinsozoa Giardia Diplomonadida Alveolata Group I Microsporidia Alveolata Group II ( Amoebophyra ) Trichomonadida Dinophyta Thermococcus barophilus Apicomplexa / Ciliates Rhodophyceae / Cryptophyceae nucleomorph Stramenopiles heterotroph B Stramenopiles heterotroph A Cryptophyceae nucleus Diatoms Eustigmatophyceae Bolidophyceae Raphidophyceae Acanthamoeba / Hartmannella Chrysophyceae Apusomonas proboscidea Phaeophyceae Dictyochophyceae Pelagophyceae Higher eukaryotes Plasmodiophorida 0.10 Choanoflagellates Chlorarachniophyceae nucleus Glaucocystophyceae Chlorophyta Cercozoa Haptophyta

Cultures

Approches et Techniques Isolement de nouvelles souches (filtration, dilution sériées, tri cellulaire) Caractérisation pigmentaire (HPLC) morphologique (MO et MET) génétique (séquençage gène ARNr 18S) => Biais dus à la mise en culture mais reste indispensable => Biais peuvent être minimisés par un tri très tôt après le prélèvement et par comparaison avec analyses directes de la diversité naturelle

Bolidophyceae Deux flagelles inégaux Même pigmentation que les Diatomées Séquence 18S les plaçant à la base des Diatomées => Nouvelle classe => Un seul genre : Bolidomonas Guillou et al. J. Phycol 1999

Pelagophyceae Pelagococcus sp. Pelagomonas calceolata

Prasinophyceae

Ostreococcus spp. 9 souches disponibles: Etang de Thau Méditerranée Manche Océan Atlantique Mer Rouge Eucaryote le plus petit : 0,8 µm

Taxons hétérotrophes Guillou et al. Protist 1999

Diversité des Populations Naturelles

Approches et Techniques Abondance picoeucaryotes par cytométrie en flux Examen systématique de la diversité génétique par DGGE (en développement) Clonage et séquençage gène ARNr 18S à partir de populations naturelles Quantification de l ’abondance des différents taxons Sondes ARNr 18S et Hybridation in situ (FISH) PCR quantitative (en développement)

Amplification gène ARNr 18S (PCR) Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Echantillon naturel < 3 µm Cultures ADN Amplification gène ARNr 18S (PCR) (Amorces à GC clamp) DGGE Librairie de clones Séquençage gène ARNr 18S Bases de données Analyses Phylogénétiques Sondes moléculaires

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Appareillage Ech. naturel Clone 1 Clone 2 Clone 3 Clone 4 GC clamp Amplicon de 18S Bain thermostaté (60°C) Gradient d’urée Système de fixation des gels Système de coulage des gels Système Dcode (Biorad)

Amplification gène ARNr 18S Echantillon naturel Librairies de Clones < 3 µm ADN Amplification gène ARNr 18S DGGE Librairie de clones Séquençage gène ARNr 18S Bases de données Analyses Phylogénétiques Sondes moléculaires

Nouvelles Lignées Eucaryotes Nouveaux groupes Moon et al. 2001

Analyse des Librairies de Clones Moon et al 2001

Analyse des Librairies de Clones Manche : Avril 2000 K. Romari, non publié

Clones Date Romari unpublished English Channel Morlaix river 1.0 0.9 Alveolata Ciliophora Alveolata Dinophyceae Alveolata Group I OLI11001 Alveolata Group II Amoebophrya Alveolata Perkinsea Chlorarachniophyta Chlorarachniophyceae Chlorophyta Prasinophyceae Choanoflagellida Cryptophyta Cryptophyceae Haptophyta Prymnesiophyceae He000427.214 LKM74 Plasmodiophorida Rhizopoda Stramenopiles Stramenopiles Bicosoecida Stramenopiles Bolidophyceae Stramenopiles Dictyochophyceae Stramenopiles Labyrinthulida Unidentified English Channel Morlaix river 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 Clones 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 April 00 June 00 Sep 00 Dec 00 April 01 May 01 June 01 May 01 (D) Romari unpublished Date

Quantification des Taxons Eucaryotes 1. Hybridation in situ

Amplification gène ARNr 18S Hybridation in situ Cellules du milieu naturel < 3 µm Hybridation in situ Cellules en culture ADN Amplification gène ARNr 18S DGGE Librairie de clones Séquençage gène ARNr 18S Bases de données Analyses Phylogénétiques Sondes moléculaires

Sondes Spécifiques des Prasinophyceae

Tests des Sondes sur Micromonas pusilla EUK1209R PRAS04 PRAS03 MICRO01

Tests de Spécificité des Sondes de Genres BATHY 01 OSTREO 01 MICRO 01 Ostreococcu s tauri - + - RCC 116 Ostreococcus oceanicus - + - RCC 143 Ostreococcus sp - + - RCC 141 Bathycoccus prasinos + - - RCC 113 Micromonas pusilla - - + RCC 114 Micromonas pusilla - - + RCC 299 Micromonas pusilla - - + RCC 373 Micromonas pusilla - - + RCC 37 2 Les sondes ne s’accrochent qu’à leur cible

Variations Saisonnières English Channel F. Not et al. unpublished

Variations Saisonnières cultures English Channel F. Not et al. unpublished

Diversité des Prasinophytes au Large de Roscoff % of eukaryotes Probe Min Max Mean PRAS03 Prasinococcales - 23% 3% PRAS04 Mamiellales 18% 100% - MICRO01 Micromonas 13% 82% 46% OSTREO01 Ostreococcus 0% 5% 1% BATHY01 Bathycoccus 0% 35% 9%

Couplage Hybridation / Cytométrie Biegala in prep

Quantification des Taxons Eucaryotes 2. PCR quantitative

Amplification gène ARNr 18S PCR quantitative Echantillon naturel < 3 µm Cultures ADN Amplification gène ARNr 18S PCR quantitative DGGE Librairie de clones Séquençage gène ARNr 18S Bases de données Analyses Phylogénétiques Amorces spécifiques

PCR Quantitative en Chimie SybrGreen 1/ Dénaturation de l’ADN 2/ Hybridation des amorces et du SybrGreen 3/ Augmentation du signal fluorescent au fur et à mesure de la PCR suivie en temps réél

PCR Quantitative Inconvénients/FISH : on ne visualise pas la morphologie cellulaire abondance relative en quantité d ’ADN plus cher Avantages/FISH : plus rapide (96/3 = 32 échantillons à la fois) plus sensible (détection : < 0.1 ng d ’ADN) (quantifie des gènes, pas directement des cellules!)

PCR Quantitative Echantillon naturel, Baie de Morlaix

Objectifs pour BIOSOPE Estimer la diversité des picoeucaryotes (auto- et hétérotrophes) en milieu hyperoligotrophe Identifier les espèces/taxons dominants Mettre en culture de nouvelles espèces et des organismes représentatifs de groupes environnementaux non encore cultivés

Perspectives à long terme Génomes de picoeucaryotes écologiquement importants (Ostreococcus, …) Métagénomique Puces à ADN (marqueurs taxinomiques) ?

THEME 2: Ecologie Moléculaire des Cyanobactéries Marines

Comparaison Synechococcus - Prochlorococcus

Types de Distributions Verticales Atlantique Tropical (proche upwelling) Pacifique Equatorial E Pacific tropical N [Syn]  [Proc] [Syn]  1/10 [Proc] [Syn]  1/100 [Proc] Partensky et al. (1999) Microbiol. Mol. Biol. Rev.

Questions Ecologiques Facteurs contrôlant la distribution différentielle de Prochlorococcus et Synechococcus ? Mécanismes d’adaptation des cyanobactéries aux forts flux de photons visibles et UV en surface des océans ? Facteurs responsables de la large distribution verticale des populations de Prochlorococcus dans les zones oligotrophes ?

« Ecotypes » de Prochlorococcus 0 m Isolement Culture 50 m lumière 100 m Différences entre souches adaptées aux basses et hautes lumières : Optimum lumineux de croissance 150 m Taux photosynthétique maximum nutrilites Rapport Chl b sur Chl a2 200 m

Diversité Génétique (16S rRNA) Prochlorococcus TATL1b Génome séquencé Prochlorococcus MIT9107 Prochlorococcus SB, TATL2 HLII Prochlorococcus MIT9302 Prochlorococcus MIT9312 High light- adapted clades Prochlorococcus GP2 Prochlorococcus TATL1a SAR 6 HLI Prochlorococcus NATL2 Prochlorococcus MED4 Prochlorococcus NATL2a Prochlorococcus PAC1 Low light- adapted clades Prochlorococcus SS120 Prochlorococcus MIT9313 Prochlorococcus MIT9303 Synechococcus WH8102 SAR 139 SAR 100 Moore et al. (1998) Nature SAR 7 Synechococcus WH8101 Synechococcus WH7805 Synechococcus PCC6301

Comparaison génomes Synechococcus - Prochlorococcus

Apports des Analyses Génomiques L ’évolution de Prochlorococcus vers une réduction de sa taille cellulaire et génomique a entraîné une perte irréversible de gènes « universels » d ’assimilation des nutrilites et le développement d ’une antenne réduite (et énergétiquement moins coûteuse) que les phycobilisomes 200 m 100 m 0 m nutrients light 50 m 150 m Conservation partielle des gènes de détection du P (phoB/R) Perte complète de la capacité d ’assimilation des nitrates & nitrites Conservation de la capacité d ’assimilation de l ’urée (N organique) Multiplication des gènes HLIP (photoprotection?) Lot minimum de gènes d ’antenne (pcb) Etat avancé d’élimination des gènes de PBS Elimination des gènes de détection du P (PhoB/R) Nitrate-, nitrite+ or -, urée+ ou - Nombre réduit de gènes HLIP Multiplication des gènes d ’antenne (pcb) Conservation des gènes de la phycoérythrine

Objectifs pour BIOSOPE Extension verticale et horizontale des différents génotypes de Prochlorococcus (gène de l’antenne et PCR-RFLP)

Amplification gène Pcb par PCR Random Fragment Length Polymorphism (RFLP) Echantillon naturel < 3 µm Cultures Amplification gène Pcb par PCR Digestion par HaeIII PCR-RFLP Librairie de clones Séquençage gène Pcb Bases de données Analyses Phylogénétiques

Garczarek, Dufresne et Partensky (en prep.) Diversité des populations naturelles de Prochlorococcus durant PROSOPE (septembre 1999) St. 3 St. 8 Prof (m) 5 25 55 80 95 110 M 5 30 70 90 110 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Garczarek, Dufresne et Partensky (en prep.) 0.1

Objectifs pour BIOSOPE Extension verticale et horizontale des différents génotypes de Prochlorococcus Caractérisation de gènes de stress (UV/forte lumière, carences) chez les cyanobactéries marines : Expression dans le milieu naturel au cours de rythmes jour-nuit

PCR Quantitative pour l’Expression Génique Echantillon naturel PCR Quantitative pour l’Expression Génique Cultures ARN ADNc Amplification gène X par PCR quantitative Librairie de clones Séquençage gène X Bases de données Analyses Phylogénétiques Amorces spécifiques

Holtzendorff et al. (soumis) Exemple de Mesure de l ’Expression Génique par PCR Quantitative (Eilat, sept. 2000) Holtzendorff et al. (soumis)

Objectifs pour BIOSOPE Extension géographique des différents génotypes de Prochlorococcus (gène de l’antenne, etc.) Caractérisation de gènes de stress (UV/forte lumière, carences) chez les cyanobactéries marines : Expression dans le milieu naturel au cours de rythmes jour-nuit Aussi possible: caractérisation de la présence / expression de gènes d’intérêt biogéochimique (ex: nifH) dans le picoplancton

Composition de l ’Equipe (fin 2002) Thème 1 Daniel VAULOT DR2 CNRS Laure GUILLOU CR2 CNRS (Oct 2002) Nathalie SIMON MdC UPMC Agnès GROISILLIER Post-doctorant (2002-2003) Isabelle BIEGALA Post-doctorant (1999-2003) Fabrice NOT Doctorat Paris 6 (2000-2003) Thème 2 Frédéric PARTENSKY CR1 CNRS Post-doctorant MARGENES (2002-2005) Isabelle MARY Doctorat Rennes I (1999-2002) Alexis DUFRESNE Doctorat Rennes I (2001-2004) Christophe SIX Doctorat Paris 6 (2001-2004) Cytométrie, cultures, etc Dominique MARIE IE CNRS AI CNRS (Florence Le GALL?) Sylvie ROUSVOAL IE CNRS (20%)