Clonage et construction de vecteur in silico Objectif Réaliser un clonage virtuel d’un ADNc codant pour une protéine d’intérêt dans un vecteur d’expression. La construction obtenue permettra l’expression de la protéine fusionnée avec une étiquette histidine en N-terminal, et ce dans 3 systèmes d’expression différents. Formation Bioinformatique 2016
Les nucléotides RAPPELS
Des nucléotides… …à l’ADN Liaisons phosphodiester
La double hélice d’ADN Les 2 brins sont orientés et antiparallèles Liaisons hydrogènes
La double hélice d’ADN Les séquences des 2 brins sont complémentaires GTACTAG CATGATC
La double hélice d’ADN
Organisation d’un gène eucaryote
Du gène à la protéine
L’ADN complémentaire (ADNc)
Les enzymes de restriction Une endonucléase (de restriction) spécifique de site (de restriction) clive l'ADN double brin sur chaque brin lorsqu'il est non modifié Sites de restriction Le site de restriction est une séquence la plupart du temps palindromique, c'est à dire qui possède un centre de symétrie.
La PCR
Extrémité non complémentaire des primers contenant le site de restriction à insérer dans le fragment PCR Site de restriction 1 Site de restriction 2 ER1 ER2
Etape 1a Digestion ER1 et ER2 ER1 ER2 ER1 ER2 Etape 1b Digestion ER1 et ER2 ER1 ER2 ER1 ER2 ER1 ER2 ADNc ACOX1 Schéma général clonage en 1 étape Etape 2 Ligation