ANATOMIE FONCTIONNELLE CLASSIFICATION MEDICALE LES BACTERIES: ANATOMIE FONCTIONNELLE CLASSIFICATION MEDICALE Introduction Bactéries : anatomie fonctionnelle - structure constantes - structure inconstantes Bactéries : classification médicale Julio Aires julio.aires@parisdescartes.fr EA 4065, Microbiologie 14 novembre 2015

bactéries Cellule épithéliales

Comparaison procaryote-eucaryote Organismes Bactéries, Archae Champignons, plantes, animaux Taille Petite taille (1-10 µm) Grande taille (10-100 µm) Information génétique 1 molécule ADN circulaire (+ plasmides) Noyau, enveloppe Synthèse des protéines Polysomes Gestion de l’énergie Membrane plasmique Mitochondries Division Scissiparité Mitose Cytoplasme Pas de compartiment intracellulaire ≠ Compartiments endo-membranaires Tableau à scanner ou T

Microbiologie : quelques dates 1673 : première observation de bactéries : animalcules, Antoni Van Leeuwenhoek (1632-1723) XVIIème-XVIIIème processus sur la fermentation transmission des bactéries : origine infectieuse des maladies Louis Pasteur Robert Koch XXème siècle : ère de la biologie moléculaire et de la « Omique » - 1995 : séquençage 1er génome bactérien Haemophilus influenzae XXIème siècle : Next Generation Sequencing (NGS), RNA Seq

Importance des bactéries Plusieurs millions d’espèces sur terre Rôles - Ecologique Microbiotes commensaux Microbiotes de l’environnement - Industriel - Pathogène

Modalités d’étude Microscopie - Optique - Electronique Biochimie Génétique Biologie moléculaire de la cellule Alberts et al. (1983)

Taille- Morphologie Coques Bacilles Formes diverses Taille: de l’ordre du micron = 1 millième de mm T

Coloration de Gram : Principe

Bactérie : anatomie fonctionnelle Structures constantes Paroi Membrane cytoplasmique Chromosome Cytoplasme Structures inconstantes Capsule Couche S Flagelles Fimbriae, Pili Spore Eléments génétiques mobiles

Schéma paroi bactéries Gram + / Gram - Milieu extracellulaire Milieu intracellulaire

Structure propre aux bactéries Coloration de Gram Paroi bactérienne Structure propre aux bactéries Coloration de Gram Gram +, Gram – Microscopie électronique Gram +: paroi épaisse Gram -: paroi hétérogène Cible des antibiotiques Gram + Gram -

Constitution chimique Paroi bactérienne Constitution chimique Osamines - acide N-acétylglucosamine (NAG) - acide N-acétyl muramique (NAM) Oses simples - Glucose, galactose, mannose, fructose - antigènes de paroi, spécificité Acides Aminés - D et L-Ala, D-glutamine, L-lysine ou l ’acide diaminopimélique Acides techoïques : bactéries à Gram + Lipides simples : bactéries à Gram – entrant dans la composition du Lipopolysaccharide (LPS) Acides mycoliques : Bacilles Acido Alcoolo Résistant (BAAR) acides gras à très longues chaînes ramifiées et méthylées

Paroi bactérienne Structure moléculaire : élément commun structural peptidoglycane = muréine ou mucopeptide - polymère de chaînes linéaires de NAG et de NAM - chaînes liés entre elles par de courtes chaînes peptidiques : tetrapeptides (L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala) au niveau de NAM - tetrapeptides reliés entre eux par transpeptidation (transpetidases=PLP) - Synthèse : 3 étapes - Remaniements : autolysines

Paroi bactérienne

Peptidoglycane : exemple Gram+ Gram-

Paroi des Gram positifs Acides teichoïques et lipoteichoïques Polymères de polyols Liés par des ponts phosphodiester à une fonction OH de certains résidus de NAM du peptidoglycane Fonctions: - Rôle antigénique - Rôle dans l’adhésion - Rôle pro-inflammatoire Polysaccharides - polysaccharide C des streptocoques Protéines - adhésines

Paroi bactéries Gram - Membrane externe LPS - Lipide A -Double couche phospholipidique asymétrique - lipopolysaccharide : LPS LPS - Lipide A - Polysaccharide central - Chaîne O LOS - sans chaîne O

Polysaccharide central Exemple : structure LPS (Salmonella Typhimurium) man abe Chaîne O spécifique rha gal glc n glc Nacglc gal Noyau externe Mutant Ra Polysaccharide central glc gal P heptose Acide céto-2-désoxy-3-octonique P P Ethanolamine Noyau interne KDO Mutant Re P P glucosamine Lipide Lipide A acides gras

Membrane externe bactéries Gram - : protéines Structure Porines Protéines de transport Protéines majeures (105/cellule) Lipoprotéine de Braun: attache de façon covalente le PG et le pôle hydrophobe de la mb ext de l’autre Porines: protéines trimériques formant des pores. Ex: ompC, ompF: permettent le passage de molécules hydrophobes. Mais exclut le passage de trop grosses molécules ompA: porine laissant passer certains ions, mais est également un site récepteur pour les pili F (stabilise les cellules pendant la conjugaison) et pour des bactériophages Récepteurs membranaires du fer Protéines mineures (100/cellule) Responsables du transport spécifique de petites molécules

Rôle : Paroi Intégrité de la cellule bactérienne protoplastes (G+) / sphéroplastes (G-) : Bactéries paroi hydrolysée Mollicutes: classe de bactéries sans paroi (Mycoplasme) Barrière LPS/LOS: endotoxines ; Chaîne O : antigénique Peptidoglycane Maintien de la forme, de la rigidité Resistance de la bactérie à la lyse osmotique Perméable aux molécules Acides teicoïques et lipoteichoïques Maintien et régulation des cations près de la paroi Rôle adhésion, antigénique, pro-inflamatoire Spécificité antigénique Intégrité de la bactérie contre la lyse osmotique et les dommages mécaniques Pression osmotique à l’intérieur d’une cellule bactérienne = 10-25 atmosphères! Ac teichuroniques: que chez bacillus, Micrococcus, Staphylococcus Rôle: à cause de leur charge – Ag: ALT=ag D des streptoc. Mycoplasmas

Différentes Parois bactériennes Gram - Gram + Mycobacteria

Paroi Mycobactéries Coloration  BAAR Paroi recouverte d’une couche cireuse = acide mycolique, composé de molécules complexes (60 à 90 atomes de C) Très épais, lié de façon covalente aux couches de glucides complexes sous-jacentes et au PG + des protéines formant des pores 2 couches: extrémités hydrophobes tournées l’une vers l’autre

Espace périplasmique Gram- Gram+ En terme structurel: espace entre la mb cytoplasmique et la mb externe En terme fonctionnel : substance occupant le compartiment (gel périplasmique) Contient le PG, polysaccharides, protéines de transport, enzymes Gram+ Enchevêtrement avec la paroi

Membrane cytoplasmique Caractérisée par sa fluidité Double couche phospho-lipidique Lipides membranaires (30-40%) phospholipides glycolipides Fluidité liée au déplacement et rotation des groupements lipidiques

Membrane cytoplasmique Propriétés de perméabilité d'une double couche lipidique artificielle sans protéines Petites molécules non chargées Grosses molécules non chargées Molécules hydrophobes ions

Membrane cytoplasmique Caractérisée par sa fluidité Double couche phospho-lipidique Lipides membranaires (30-40%) phospholipides glycolipides Protéines (60-70%) protéines intrinsèques (insérées dans les lipides) protéines extrinsèques (facilement détachables) =fixées en surfaces Sucres (2-15%) protéines (glycoprotéines) lipides (glycolipides) Fluidité liée au déplacement et rotation des groupements lipidiques

Exemple modes de transport Membrane cytoplasmique Exemple modes de transport

Systèmes de sécrétion Système Sec-dépendant Source d’énergie = hydrolyse de l’ATP Synthèse d’un précurseur = protéine + peptide signal Clivage du peptide signal Libération de la protéine mature Peptide signal = 18-26AA chez les gram -, jusqu’à 45AA chez les gram + Ce peptide sera clivé au moment de la translocation au travers de la mb cytoplasmique AA C terminaux de ce peptide signal sont importants pour sa reconnaissance et son clivage La voie la + étudiée = sec dépendante = complexe protéique Protéine naissante non repliée = donc capable de transloquer Voie d’excrétion Tat (Twin-arginine-translocation): protéine a un motif AA caractéristique avec des arginines consécutives dans le peptide-signal Les protéines sont repliées avant d’être excrétées. Exemple chez Gram -: - mécanismes complémentaires - plusieurs systèmes de sécrétions

Structural organization of the secretion systems that span the double membrane of Gram-negative bacteria 2015

Membrane cytoplasmique : fonctions Fonction respiratoire et production d’énergie Barrière perméabilité sélective transport de substances solubles Protéines de transport Systèmes de sécrétion Protéines « senseurs » Protéines de liaisons Ancrage : flagelles Rôle dans la synthèse de constituants bactériens (ex: PLP) Translocation de signaux à la machinerie génétique et métabolique Excrétions d’enzymes Protéines senseurs: mesure la concentration des molécules ds l’environnement Protéines liantes = binding prot

CYTOPLASME Chromosome Ribosomes 70S: 30S + 50S synthèse des protéines Cible antibiotiques Protéines, sels minéraux, granulation (réserve) Pigments

CHROMOSOME BACTERIEN Chromosome unique, circulaire Pas de membrane nucléaire Double hélice ADN Différentes topologies : super-enroulée, relâchée, linéaire Réplication semi-conservative, bidirectionnelle Rôles Support de l’information génétique Rôle en taxonomie, épidémiologie Cible des antibiotiques … E. coli "gently lysed“…

Bactérie : anatomie fonctionnelle Structures constantes Paroi Membrane cytoplasmique Chromosome Cytoplasme Structures inconstantes Flagelles Fimbriae, Pili glycocalyx Couche S Spore Eléments génétiques mobiles

} Flagelles Organes de locomotion : filament polymère de flagelline Flagelle bactérien filament crochet Corps basal }

Flagelles Structure : filament polymère de flagelline, spécifique de l’espèce Flagelle bactérien filament crochet Corps basal }

Flagelles Différentes types : nombre et positions variable Péritriche Lophotriche Monotriche Fonctions - Mobilité - Colonisation - Chimiotactisme - Propriétés antigéniques (stéréotypage, diagnostique sérologique) - Induction cytokines pro-inflammatoires réponse immunitaire

Pili ou Fimbriae Fonctions Appendices courts et fins , surtout Gram- Implantés dans la mb externe, voire mb cytoplasmique 1 protéine = piline, arrangée de façon hélicoïdale Droits, ne tournent pas, pas de corps basal Fonctions Différentes fonctions Adhésion cellules / surfaces : colonisation, 1ère étape de l’infection Rôle dans la conjugaison Mobilité (≠ «twitching», «swarming») Surtout chez le gr -, + rarement chez les gr + Droits…pour les différencier des flagelles

Glycocalyx Certaines bactéries : couche supplémentaire = glycocalyx recouvre : peptidoglycane Gram +; membrane externe Gram- Deux types Slime : structure fibrillaire de sous unités glycoprotéiques - Couche diffuse, facilement détachable Exemples : dextran S. mutatns (plaque dentaire) ; alginate P. aeruginosa (mucoviscidose) Capsule : - structure polysaccharides: colonies lisses+/- muqueues épais, compacte, solidement attaché à la paroi non colré par coloration de Gram (halo claire) , visible encre de chine, ME

Slime Fonction attachement des bactéries - aux cellules (buccales, respiratoires, plaque dentaire) (cathéters, prothèses, instruments) formation de biofilms - forme de résistance - dissémination Etapes de formation d’un biofilm S aureus sur un cathéter

Capsule Fonctions Antigénique Immunogène Facteur de virulence +++ - adhésion, antiphagocytaire antigénicité Exemple: capsule d’E coli K1 et méningocoque B = haptène proche des molécules adhésives neurales néonatales - protection bactériophages Dans l’environnement : protège de la dessiccation, procure des nutriments (sucres)  biofilms

Rôle du glycocalyx Adhérence 1ère étape de la colonisation et de l’infection Pouvoir pathogène Agrégation des bactéries, constitution de micro-colonies Résistance phagocytose Barrière pour certains antibiotiques  Capsule = charges polyanions ATB polycations (aminosides, polymixine) : neutralisation des charges des ATB polycations => perte efficacité Pouvoir antigénique sérologique vaccins dirigés contre ces composés de surface - vaccins polysaccharidiques

Couche S Face externe de la paroi Gram + et Gram – Arrangement géométrique de sous-unités protéiques (ME) Barrage filtrant permettant la concentration de molécules excrétées par la bactérie dans un environnement proche? Rôle protecteur vis-à-vis de bactériophages, de la phagocytose, fixation du complément Facteur d’adhésion

Spore Formes de résistance Elles apparaissent lorsque la bactérie se trouve en conditions défavorables Formation à l'intérieur des cellules bactériennes, d'où le nom d'endospores Endospores : cellules bactérienne spécialisée Différents genres bactériens Importance pratique : microbiologie médicale - physiopathologie de certaines infections (C. difficile) ésinfection de niveau sporicide

Spore bactérienne : Mise en évidence Etat frais - structures réfringentes Coloration non spécifique : coloration de Gram - espaces vides à l’intérieur des bactéries    Coloration spécifique : - Coloration de Schaeffer (vert Malachite, contre coloration Fushine) - Coloration de Moeller (fuschine de Ziehl à chaud + bleu de méthylène)

Spore bactérienne : morphologie Ovales ou sphériques Position dans la cellule est variable : centrale, terminale, subterminale Spore déformante Libre ou non Rôle taxonomique

Spore : propriétés Thermorésistance Résistance aux agents physiques Varie considérablement d’une espèce à l’autre En général survie après 10 min à 70-80°C La plus résistante: 8h à 100°C / 5 min à 120°C Résistance aux agents physiques UV, rayons X, ultra-pressions Résistance aux agents chimiques moins sensibles aux antiseptiques / désinfectants / antibiotiques antibiotiques = sporostatiques Ribosomes Exosporium: enveloppe mince et délicate, structure lipoprotéinique Tunique, sous l’exosporium, composée de quelques couches protéiques de type kératinique, peut être assez épaisse Elle est imperméable et est responsable de la résistance de la spore aux produits chimiques Cortex: peut occuper plus de la moitié du volume de la spore, localisé sous la tunique: il est constitué de PG, moins ponté que celui de la cellule végétative, sensible au lysozyme Protoplaste: possède toutes les structures cellulaires (ribosomes, nucléoïdes)

Sporulation Forme végétative Stade I organisation du chromosome en 2 génomes Stade II formation d’un septum de sporulation Stade III Individualisation d’une membrane cytoplasmique et paroi Forme végétative La cellule mère se lyse et libère la spore Phénomène réversible après stimulation Stade V Formation tuniques et exosporium Stade IV Formation du cortex Stade VI Maturation de la spore

Spore : germination 1ère phase: activation 2ème phase: germination Indispensable Réversible Mécanique (choc, abrasion), chimiques (acidité), thermique (65° et 95°C) 2ème phase: germination Conditions favorables: Hydratation, Métabolites effecteurs  Processus autolytique Perte de la résistance 3ème phase: croissance  Naissance d’une bactérie active Activation raccourcit le temps de germination Pénètrent à travers la tunique endommagée

Cycle sporulation / germination

Eléments génétiques mobiles Plasmides Transposons Intégrons

Transferts génétiques

CRISPR Clustered Regulary Interspaced Short Palindromic Repeats mécanisme de défense immunitaire adaptatif

Croissance bactérienne Division bactérienne par scissiparité

Croissance bactérienne: besoins Différentes voies métaboliques en fonction de l’environnement

Croissance bactérienne Différents types trophiques bactériens Source d’énergie Chimiotrophe Chimique Phototrophe Lumineuse Autotrophe Inorganique CO2 Hétérotrophe Organique sucres, acides aminés Source de carbone Lithotrophe Inorganique Organotrophe organique Source d’électrons

Classification médicale des bactéries permet de regrouper les bactéries en fonction de critères ou caractères communs Nomenclature Espèce : unité fondamentale de la classification regroupe les organismes possédant caractères communs à l’intérieur d’une même espèce : distinction souches / clones - souche : sous-division d’une espèce - clone : population descendant d’une même souche  Identification

Classification médicale des bactéries selon : La cause de grands syndromes Responsables de méningites, d’endocardites… Un même mécanisme pathogénique Bactéries responsable de toxi-infections Bactéries à multiplication intracellulaire Leurs caractères Biochimiques => biotypes, biovar Antigéniques => sérotypes, sérovars Pathogéniques => pathotypes, pathovars Sensibilité aux antibiotiques => antibiotypes Sensibilité aux bactériophages => lysotypes Moléculaires (identification ADN par ribotypie, hybridation ADN-ADN, hybridation ADN-ARN, séquençage ARN ribosomique,…) Bactéries non cultivables in vitro, difficiles à cultiver

Classification médicale des bactéries selon : la coloration de Gram la morphologie la mobilité la capacité à sporuler la température de croissance les besoins nutritionnels le mode respiratoire la capacité de photosynthèse l’utilisation des différentes sources de carbone ou d’azote le G+C% du génome

Identification Caractères morphologiques Bacilles, cocci, Gram+/- Caractères biochimiques Caractères antigéniques.... Biologie moléculaire Sensibilité aux antibiotiques Spectrométrie de masse

Quelques exemples… Staphylococcus aureus Salmonella sp Cocci à Gram +, coagulase + Méthicillino-résistant Producteur de la leucocidine de Panton Valentine Salmonella sp Bacille à Gram négatif, oxydase -, entérobactérie 1 seule espèce: enterica Détermination des caractères antigéniques (AgO, AgH, AgVi) Recherche de marqueurs épidemiologiques Escherichia coli entérobactérie Commensal Pathovars: ECEH (O157:H7, O104:H4) Marqueurs épidémiologiques => clone?

ANATOMIE FONCTIONNELLE CLASSIFICATION MEDICALE LES BACTERIES: ANATOMIE FONCTIONNELLE CLASSIFICATION MEDICALE Introduction Bactéries : anatomie fonctionnelle - structure constantes - structure inconstantes Bactéries : classification médicale Julio Aires julio.aires@parisdescartes.fr EA 4065, Microbiologie 14 novembre 2015