DIAGNOSTIC DIFFERENTIEL ENTRE MGUS ET MYELOME PAR CYTOMETRIE EN FLUX MULTIPARAMETRIQUE : 1 TUBE (4 COULEURS). GRANDJEAN F. Laboratoire de biologie clinique Cliniques du Sud-Luxembourg Arlon BELGIQUE

Présentation Introduction Méthodes Résultats Conclusion Définitions : myélome et MGUS Critères de diagnostic (Salmon & Durie) Système de stadification des myélomes Myélome et cytométrie en flux Méthodes Résultats Conclusion

Introduction Pathologie plasmocytaire = Expansion d’un clone de lymphocyte B sécrétant une immunoglobuline. Différentes pathologies avec des pronostics très différents : Myélome multiple Plasmocytome Amyloïdose Myélome ostéosclérotique (POEMS) MGUS MGUS = Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. Regroupent la plupart des pics monoclonaux découverts dans la pratique quotidienne. Chaque année, 1% de ces malades va développer un authentique myélome. Il n’existe donc pas d’hiatus entre MGUS et myélome, mais plutôt une sorte de continuum qui vient de se voir conforter par toute une série d’anomalies cytogénétiques similaires dans les 2 affections. Plasmocyte = Stade de différenciation ultime du lympocyte B, associé à la production d’une immunoglobuline spécifique d’un antigène (en réponse à une infection).

Introduction Myélome multiple (MM) ou maladie de Kahler : prolifération maligne de plasmocytes, initialement localisée à la moelle osseuse. Sécrétion par les plamocytes myélomateux d’un type unique d’immunoglobuline (monoclonale) que l’on peut retrouver dans le sang et les urines. Lésions ostéolytiques extensives (hypercalcémie, fractures spontanées, douleurs osseuses). Anémie. Infections fréquentes. MM = Néoplasie médullaire caractérisée par la présence d’une protéine monoclonale sérique, de lésions ostéolytiques et par l’anémie. MGUS = Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance. Regroupent la plupart des pics monoclonaux découverts dans la pratique quotidienne. Chaque année, 1% de ces malades va développer un authentique myélome. Il n’existe donc pas d’hiatus entre MGUS et myélome, mais plutôt une sorte de continuum qui vient de se voir conforter par toute une série d’anomalies cytogénétiques similaires dans les 2 affections. Il faut néanmoins les séparer pour des raisons de pratiques évidentes : MGUS pas de traitement, myélomes peuvent requérir une thérapeutique. Sécrétion par les plasmocytes du myélome d’activateurs de la résorption ostéoclastique du tissu osseux avec sécrétion d’IL-6 par les cellules du microenvironnement médullaire (cellules dendritiques) en retour (stimulation prolifération plasmocytaire). Diagnostic différentiel avec la gammapathie monoclonale bénigne (MGUS). Composant monoclonal présent mais à faible concentration. Plasmocytose médullaire < 10%. Absence de lésions lytiques. Absence des symptômes liés au myélome.

ou 3 critères mineurs, incluant le (1) et le (2) Distinction entre MGUS et MM sur base de la classification de Salmon & Durie : Myélome Multiple  au minimum 1 critère majeur et 1 mineur ou 3 critères mineurs, incluant le (1) et le (2) Critères majeurs : Plasmocytose médullaire (> 30%) Plasmocytome à la biopsie Composant monoclonal : Sérum : IgG > 3,5 g/dl, IgA > 2 g/dl Urine > 1 g/24h ou protéinurie de Bence-Jones Ces critères doivent être présents chez un patient symptomatique avec une pathologie progressive. Critères mineurs : Plasmocytose médullaire (10-30%) Composant monoclonal : présent mais inférieur aux taux ci-dessus Lésions ostéolytiques Immunoglobulines normales réduites (<50% valeurs normales) IgG < 600 mg/dl, IgA < 100 mg/dl, IgM <50 mg/dl

Comparaison MGUS / Myélome latent et indolent :     Ces critères doivent être présents chez un patient symptomatique avec une pathologie progressive.

Système de stadification des myélomes : Stade I : Composant monoclonal à faible taux : IgG < 5g/dl, IgA < 3g/dl; Urine BJ < 4g/24h Lésion ostéolytique absente ou solitaire Taux d’hémoglobine, calcium sérique et d’Ig (non-monoclonales) normaux Stade III : Composant monoclonal à taux élevé : IgG > 7g/dl, IgA > 5g/dl; Urine BJ 12g/24h Lésions ostéolytiques multiples et développées Taux d’hémoglobine < 8,5 g/dl, calcium sérique > 12 mg/dl Exemples : Stade IA = faible masse tumorale myélomateuse (< 0.6X1012/m²) avec fonction rénale normale. Stade IIIB = masse tumorale myélomateuse importante (> 1.2X1012/m²) avec fonction rénale anormale. Stade II : La plupart des valeurs comprises entre I et III  Sous-classification basée sur la fonction rénale : A = créatinine sérique < 2 mg/dl B = créatinine sérique > 2 mg/dl

Myélome et cytométrie en flux : Analyse des plasmocytes en cytométrie en flux complexe : Faible représentation dans les ponctions médullaires. Perte au cours de la maturation plasmocytaire de nombreux marqueurs de la lignée B (CD19, CD20, CD22) et du marqueur d’expression pan leucocytaire CD45. Expression d’un marqueur spécifique CD138 et expression forte du CD38. Expression et rôle du CD56 (malignité?) Distinction entre MGUS et MM sur base de la classification de Salmon & Durie. Mais différenciation difficile entre MGUS et MM de stade I. Ces dernières années, l’immunophénotypage des myélomes multiples (MM) a souvent été débattu. En effet, l’analyse des plasmocytes en cytométrie en flux est rendue complexe d’une part, suite à leur faible représentation dans les ponctions médullaires (malgré une présence morphologique évidente dans les biopsies), et d’autre part, suite à la perte en cours de maturation de la plupart des marqueurs associés à la lignée B. Les cytométristes ne sont pas encore parvenus à un consensus quant à une combinaison de marqueurs à utiliser pour distinguer les plasmocytes normaux et tumoraux. Les MGUS ne demandent pas de traitement, les myélomes peuvent requérir une thérapeutique. La distinction entre les 2 entités se fait au moyen de critères édictés par Salmon & Durie. Le diagnostic entre MGUS et MM de stade 1 reste cependant difficile. Dans cette étude, nous avons évalué différentes combinaisons de marqueurs pour réaliser l’immunophénotypage des plasmocytes de différentes ponctions médullaires (MGUS, MM et autres). Le but final étant de déterminer celle qui nous semblait la meilleure pour faire la distinction entre MGUS et MM. Dans cette étude, nous avons évalué différentes combinaisons de marqueurs pour réaliser l’immunophénotypage des plasmocytes de différentes ponctions médullaires (MGUS, MM et autres).

Méthodes Nous avons testé 2 combinaisons de marqueurs différentes pour phénotyper les plasmocytes de 47 prélèvements médullaires. Matériel : cytomètre = FACSCalibur (Becton Dickinson). 2 Combinaisons de marqueurs testées : CD38FITC (clone LD38, Cytognos) / CD19PE (clone HD37, Dako) / CD45PerCP (clone 2D1, BD) / CD138APC (clone B-B4, BD) CD38FITC (clone LD38, Cytognos) / CD19PE (clone HD37, Dako) / CD45PerCP (clone 2D1, BD) / CD56APC (clone NCAM 16.2, BD)

Méthodes Acquisition : Critères de collection : STOP acquisition après 750 événements comptés dans R2 (plasmocytes CD38 high, intensité d’expression > 10²).

Méthodes Analyse : Les plasmocytes sont obtenus par gating sur base d’une sélection CD45/CD38 high (intensité d’expression > 10²) réalisée sur les cellules mononucléées (R1). Sur le dot-plot CD45/CD38, on peut clairement distinguer 2 populations plasmocytaires chez ce patient qui a été greffé.

Méthodes Analyse : Les seuils de positivité du CD19 et du CD56 sont déterminés par autofluorescence. Le seuil de positivité pour le CD45 est placé arbitrairement aux alentours de 10².  A partir de cet histogramme, on sélectionne une fenêtre R3 qui va être assignée aux autres histogrammes dans lesquelles seules les données correspondant aux événements de la région seront acquises. Les seuils de positivité du CD19 et du CD56 sont déterminés par autofluorescence, le seuil de positivité du CD45 est placé arbitrairement aux alentours de 10 exp2. On remarque clairement ici 2 populations phénotypiquement distinctes.

Méthodes Plasmocytes « normaux » Plasmocytes myélomateux On peut donc visualiser le phénotype des plasmocytes normaux et celui des plasmocytes myélomateux.

Résultats Nous avons réparti les résultats des différentes ponctions médullaires en 3 groupes en fonction du score de Salmon & Durie et du stade de la maladie des patients : Groupe 1 : Moelles normales + MGUS. Groupe 2 : Myélomes latents + stades I. Groupe 3 : Stades II et III. Groupe 1 : 24 (testés pour le 56 : 19) Groupe 2 : 11 (testés pour le 56 : 4) Groupe 3 : 12 (testés pour le 56 : 5)

Résultats On peut observer : Une diminution de l’expression du CD138 sur les prélèvements non-analysés directement (liée à l’apoptose des plasmocytes). Un seuil de positivité de 20% des plasmocytes pour le CD19 qui permet de faire la distinction entre le groupe 1 et les groupes 2 et 3. Une expression partielle du CD56 sur les plasmocytes de moelles normales, ce qui empêche ce dernier de représenter un marqueur absolu de MM.  Cfr Orfao + Belgian consensus for flow cytometry

Un seuil de positivité de 20% des plasmocytes pour le CD19 permet de faire la distinction entre le groupe 1 et les groupes 2 et 3.

Expression plus importante du CD45 dans le groupe 1.

Expression partielle du CD56 sur les plasmocytes dans les moelles « normales ». Groupe 1 : 24 (testés pour le 56 : 19) Groupe 2 : 11 (testés pour le 56 : 4) Groupe 3 : 12 (testés pour le 56 : 5)

Conclusion La combinaison en 1 tube / 4 couleurs (CD38/CD19/CD45/CD56) : Fournit des indications importantes permettant le diagnostic différentiel entre MGUS et MM. Dans notre laboratoire, remplace la recherche des chaînes légères intracytoplasmiques, qui détermine l’origine clonale des plasmocytes mais ne permet pas de distinguer MGUS et MM. Dans le suivi de la maladie résiduelle, permet également la distinction entre les plasmocytes « normaux » et les plasmocytes myélomateux. Si possibilité en 5 couleurs : CD38/CD19/CD45/CD56/CD138 Testée également sur les poches de cryoconservation de cellules souches dans le cadre des autogreffes de moelle pour le traitement de MM (> à la chimiothérapie conventionnelle chez les gens qui peuvent la supporter même si l ’autogreffe ne guérit pas) : passage de plasmocytes myélomateux dans les poches de cellules souches. On pourrait imaginer un système de scoring comme pour Matutes-catovsky dans les LLC ???