Stress-Dependent Regulation of FOXO Transcription Factors by the SIRT1 Deacetylase Analyse d'article

I. Introduction - Problématique

Quelques paramètres pouvant faire varier la longévité d'un organisme Effet de la restriction calorique sur la longévité d'une population de rats Le même type de courbe est obtenu pour l'effet d'un stress sur la longévité

Sir2, régulateur central de la longévité chez la levure - Délétion de Sir2 => Suppression de la réponse à la RC et au stress chez la levure - Permet de limiter la formation des ADNr circulaires en contrôlant la recombinaison - Mode d'action: désacétyle les résidus lysines acétylés: Cible-Lys-acétyl Cible-Lys NAD Nicotinamide + O-acétyl ADP ribose Sir2 - Les cibles de Sir2 peuvent être des histones (régulation épigénétique), mais aussi d'autres protéines

Sir2 et le contrôle de la longévité chez les mammifères? - Il existe 7 homologues de Sir2 chez les mammifères. Le plus proche: SIRT1 - Chez Caenorhabditis elegans: les protéines de la famille Sir2 interagissent avec Daf-16. Daf-16 = facteur de transcription de la famille FOXO - Chez les mammifères: il existe 4 protéines de la famille FOXO (1, 3, 4, et 6) Première question posée: Chez les mammifères, existe-t-il une interaction directe entre SIRT1 et une protéine FOXO? - Chez les mammifères, les protéines FOXO contrôlent des évènements liés à la longévité (réparation de l'ADN, détoxification des ROS, arrêt du cycle cellulaire, apoptose) D'où la deuxième question posée: Dans le cas où il existe une interaction directe entre SIRT1 et une protéine FOXO, quelles sont les effets sur la régulation des évènements moléculaires liés à la longévité?

II. Techniques utilisées je verrai à la fin si je fais cette partie ou pas

III. Résultats et interprétations

Première question posée: Chez les mammifères, existe-t-il une interaction directe entre SIRT1 et une protéine FOXO?

FOXO est-il acétylé dans les cellules de mammifères? -> Condition nécessaire à sa régulation par SIRT1 Expériences de Western Blot Cellules de la lignée 293T exprimant la forme “flag-tagged” de FOXO3 Anticorps anti- - La protéine FOXO3 est acétylée dans la cellule - Le degré d'acétylation est fortement augmenté en présence d'un stress oxydant (H2O2) - Expérience supplémentaire: Les acétylases p300/PCAF interagissent avec les protéines FOXO en présence de stress -Remarque: qu'en est-il de FOXO1, 4, et 6 ?

-> Condition nécéssaire à la régulation de FOXO3 par SIRT1: Y a-t-il colocalisation de FOXO3 et SIRT1 dans la cellule? Culture de fibroblastes Ccl39 transfectés par la forme “HA- tagged” de FOXO3 Immunofluorescence avec Ac anti- HA -> étude de la localisation de FOXO3 En condition de stress oxydatif, FOXO3 et SIRT1 sont tous les 2 présents dans le noyau.

SIRT1 et FOXO3 peuvent-ils interagir? Cellules 293T co-transfectées avec “Flag-tagged” SIRT1 et “HA- tagged” FOXO3 Immunoprécipitation de SIRT1 suivie d'un Western Blot de FOXO3 - > Détection du complexe SIRT1/FOXO3 SIRT1 et FOXO3 interagissent, et l'interaction est stimulée par certains stress (oxydatif, heat shock, menadione)

L'interaction SIRT1/FOXO3 est-elle détectable lorsque les 2 protéines sont exprimées à leur niveau endogène dans la cellule? cellules 293T neurones granuleux du cervelet L'interaction entre les deux protéines est détectables losque elles sont exprimées à leur niveau endogène, et est stimulée par un stress oxydatif

La co-localisation de SIRT1 et FOXO3 est-elle suffisante à leur interaction? TM = forme mutée de FOXO3 où les sites de phosphorylation ont été supprimés En l'absence de stress, la simple co-localisation des deux protéines ne semble pas suffisante pour leur interaction Expérience supplémentaire (spectroscopie de masse): Le stress induit la phosphorylation de FOXO3 => Des acétylations et phosphorylation de FOXO3 pouvant être induites par des conditions de stress semblent nécessaires à leur interaction

FOXO3 est-il le substrat direct de SIRT1? -> Expériences in vitro PCAF et p300 = acétylases FOXO3 acétylé in vitro par PCAF ou p300 est le substrat direct de SIRT1 en présence de NAD

Que se passe-t-il in vitro lorsque l'acétylation de FOXO3 est causée par des conditions de stress in vivo? BML-210: inhibiteur de SIRT1 TSA: inhibiteur des HDACs de classe I et II In vitro, SIRT1 désacétyle FOXO3 préalablement acétylé par des conditions de stress in vivo

FOXO3 est-il le substrat de SIRT1 in vivo? (FOXO3 endogène) Inhibiteur HDACs Dans la cellule, FOXO3 est désacétylé par SIRT1 mais aussi par les HDACs de classe I et II