Microscopie confocale à balayage laser Romain Morichon IFR 65 Site St Antoine

Principe microscope confocal Marvin Minsky Informaticien et roboticien américain Créateur de l’intelligence artificielle et le père du confocal (1957)

Structure des plateformes Plateformes d'imagerie cellulaire Font partie de l'IFR 65 Regroupement 15 équipes INSERM, 10 équipes d'accueil P6. Plateforme Tenon 1 SP1 Leica (1998), 200K€ 1 SP2 Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K€ Plateforme St Antoine 1 SP2 Leica (2012) 1 Spinning disk (2008) 350K€

GFP

Principe microscope confocal

Au niveau de l’échantillon

Microtubule F-Actine Noyaux Exemple Cellule Hela Epifluorescence Confocal Microtubule F-Actine Noyaux

Résolution Microscopie conventionnelle dxy = 0,61./ON dxz= 2./ON2 Microscopie Confocale dxy = 0,4./ON dxz= 1,4./ON2 Gain : 15% en latérale 30% en axiale Exemple : 100X 1,4ON à 488nm Conventionnelle: dxy= 210nm dxz= 500nm Confocale dxy= 140nm dxz= 350nm

Quelques exemples de confocal Zeiss LSM 710 Nikon A1+ Leica SP5 Olympus FLUOVIEW 1000

Leica SP5 LASER AOTF

LASER comme source de lumière Source lumineuse monochromatique intense Différents types de LASER: Ar 457nm, 488nm, 514nm ArKr 488nm, 568nm, 647nm HeNe 543nm HeNe 633nm Diodes 405nm ou 488nm ou 561nm…

Choix des Fluorochromes 514nm 561nm Alexa 568 Alexa 568 Choisir les fluorochromes en fonction des lasers disponibles. Plus l’excitation sera loin du maximum d’absorption plus l’émission sera faible. 543nm Alexa 568

AOTF L’interaction entre la lumière et une onde acoustique produit une diffraction de la lumière. A partir d’une fréquence acoustique donnée on sélectionne une longueur d’onde. Possibilité de sélectionner jusqu’à 8 raies et d’en moduler leurs intensités Laser 1 Laser 2 Laser 3 Laser 4 Laser 5

Leica SP5 AOBS

Courbe de transmission AOBS vs Dichroique Permet de supprimer les filtres dichroïques classiques qui ont des caractéristiques fixes et une bande passante faible. possède une grande flexibilité et une meilleure efficacité permet de réduire la puissance de laser tout en réalisant des acquisitions plus rapides permet de contrôler jusqu'à 8 raies lasers de façon séquentielle ou simultanée. Courbe de transmission

Leica SP5 Système de balayage XY Système de balayage Z

Balayage XY Effectué par 2 miroirs orientés par des moteurs galvanométriques ou résonnants Balayage x en continu Balayage y incrémenté Vitesse de balayage 200, 400, 800 ou 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire et jusqu’à 8000Hz pour un résonnant. GSI Lumonics OSS 2500 1 2 Uni 1 Bi 2

Vitesse de balayage

Balayage Z En bougeant l’objectif En bougeant la platine Z drive: grande amplitude, précision 10nm Objectif piezo: faible amplitude (400µm), grande précision (n) En bougeant la platine Piezo: faible amplitude (500µm), grande précision (nm) Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande précision (10nm)

Leica SP5 Pinhole

Pinhole Confocal Non confocal

Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU ouverture du pinhole d < 0.7AU Diamètre d’ouverture faible -> Section optique fine =résolution Z élevée =Signal récupéré faible d > 1AU Diamètre d’ouverture élevé -> Section optique épaisse =résolution Z faible =Signal récupéré élevé Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU

Leica SP5 Système de détection

Prisme/fente spectrale PMT PMT PMT PMT PMT

PMT PMT Rendement 40% Photodiode Rendement 80%

Gain et offset Gain: Amplifie le signal d’entré -> luminosité de l’image augmentée Offset: Permet d’enlever le bruit fond de l’image Lut « glow over/under » Effet de saturation Épaisseur=0,85µm Épaisseur=1,35µm

Image Chaque pixel (picture element) a une coordonnée et une valeur d’intensité. Format de l’image 512x512, 1024x1024, 2048x2048… Pour du qualitatif -> Intensité codée sur 8 bits (256 niveaux de gris) Pour du quantitatif -> Intensité codée sur 12 bits (4096 niveaux de gris) L’œil ne perçoit que 30 à 40 niveaux de gris

Résolution La capacité d’un système optique à distinguer deux points distincts. Combien de pixel ais je besoins pour reproduire l’objet avec la meilleur résolution? -> Critère de Nyquist Pas d’échantionnage = r/2,3 1024X1024 256X256 Exemple: Objectifs Longueur d’onde (nm) ON Rxy (nm) Taille du pixel (nm) Zoom 512x512 1024x1024 2048x2048 63X 500 1,4 160 70 4X 2X 1X

Moyennage 2X 8X Sans Fait la moyenne arithmétique de chaque valeur d’intensité de chaque pixel Amélioration du rapport signal/bruit Moyennage par ligne utilisé pour expérimentation sur le vivant

Accumulation Sans 2X 4X Les valeurs d’intensités mesurées sont additionnées pour chaque point de balayage => Permet d’augmenter le signal en cas de marquage faible

Zoom Une zone plus petite est scannée avec le même nombre de pixels -> la résolution reste constante, Les détails sont augmentés Zoom 1 Zoom 2 Zoom 4

Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches! Multimarquage Attention au chevauchement de spectres Acquisition simultanée 488 + 568 a = Anti RF(Alexa 488) b = C12 Bodipi 568 c = Merge a b c Acquisition séquentielle 488 puis 568 d = Anti RF(Alexa 488) e = C12 Bodipi 568 f = Merge d e f PMT 2 Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches!

Acquisition Acquisition de 80 images à 200nm d’intervalle en 1024x1024 sections optiques Acquisition de 80 images à 200nm d’intervalle en 1024x1024 Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire Projection

Reconstruction 3D

Coupe XZ Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire Coupe XY Accumulation apicale de MDR3 Coupe XZ

Co-localisation A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546 B anti CD-3 / Alexa Fluor 633 C Merge

Time Laps Cellules MA104 Sonde Calcium MC164 cagée Sonde desestérifiée dans cellule, devient fluo quand fixée au Ca Acquisition toutes les 10 secondes de 5 coupes

Applications

Microscope confocal biphoton GFP : 1 photon à 488nm 2 photons à 960 nm… Confinement de l’excitation laser -> pas de pinhole -> moins de photons perdus Grande profondeur d’observation (jusqu’à 300µm) Pas de photoblanchiement hors du plan focal

Préservation échantillon Résolution Rapidité Multicouleurs Échantillon épais Microscope confocal - ++ + Microscope Biphoton Spinning disk Apotome Vidéo microscope

Merci à tous pour votre attention