Translocation of surface-localized effectors in type III secretion Karen Akopyana,1, Tomas Edgrena,1, Helen Wang-Edgrena, Roland Rosqvista,b, Anna Fahlgrena, Hans Wolf-Watza, and Maria Fallmana,2 Department of Molecular Biology, Laboratory for Molecular Infection Medicine Sweden, Umeå Centre for Microbial Research, and bThe Electron Microscopy Platform at the Chemical Biological Centre, Umeå University, SE-901 87 Umeå, Sweden Edited* by Thomas J. Silhavy, Princeton University, Princeton, NJ, and approved December 21, 2010 (received for review September 16, 2010) Responsable de l’atelier Sophie BLEVES Lamia MEBARKI

Introduction Définitions Beaucoup de bactéries Enteropathogènes possèdent un système de sécrétion type III ( SST3) essentiel pour leurs virulence, capable de produire des interactions entre la bactérie et la cellule eucaryote par la translocation directe des protéines virulentes dans le cytosol de la cellule hôte. Selon le mode de vie de l’agent pathogène, les protéines effectrices transloquées interférent avec différentes voies de signalisation et de régulation de la réponse immunitaire innée dans la cellule hôte ce qui fait pencher la balance en faveur de le bactérie. Chez Yersinia Les pathogènes de Yersinia: 3 espèces Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis y. pestis SST3 plasmidique

Les effecteurs transloqués sont appelés: Yops qui permettent la survie extracellulaire des Yersinia Action antiphagocytaire + apoptose du macrophage Injection des effecteurs en UNE étape à travers un canal continu construit par Ysc/Yop SST3 Deux protéines secrétées appelées translocateurs: YopB et YopD Translocation des protéines effectrices dans la cellule cible YopB et YopD ont un domaine hydrophobe et peuvent être insérées dans les membranes des érythrocytes + cellules nucléées Formation d’un pore

La liaison de Yersinia + cellule cible déclanche la sécrétion et l’insertion de YopB et YopD dans la membrane plasmique de la cellule cible, en complétant le conduit entre la bactérie et la cellule cible par le complexe d’aiguille SST3. Les effecteurs sont transportés dans le cytoplasme de la cellule hôte via ce pore pendant l’étape de translocation. Objectifs: Les mécanismes conduisant à la translocation des protéines SST3 dépendantes. Les conditions qui permettent la translocation des effecteurs in vitro. Montrer que les protéines effectrices associées à la surface des cellules sont transportées d’une manière SST3 dépendante.

? Résultats Localisation des Yops Cellules HeLa infecté par Yersinia pseudotuberculosis YopE Immunoelectron Microscopy ? La membrane externe de la bactérie est en contacte étroit avec la membrane de la cellule HeLa Aucune structure de transition. Aucune organisation spatiale.

YopE n’est pas localisé avec les protéines yscF de l’aiguille Localisation de YopE dans une souche de Y. pseudotuberculosis wilde type YPIII/pIB102 avant le contacte avec la cellule cible. yscF proteinA-gold 5 nM= YopE 10 nM= yscF YopE n’est pas localisé avec les protéines yscF de l’aiguille

Traitement a la protéinase K les Yops sont localisés sur la surface de Y. pseudotuberculosis avant le contacte avec la cellule cible.

Rôle de YopH localisé a la surface des cellules de Y Rôle de YopH localisé a la surface des cellules de Y. pseudotuberculosis Les YopH localisés à la surface des cellules peuvent bloquer immédiatement la réponse précoce en Ca2+ dans les neutrophiles infectés.

the Virulence Effector YopH Anderson et al; 1999 Yersinia pseudotuberculosis-Induced Calcium Signaling in Neutrophils Is Blocked by the Virulence Effector YopH

L’ajout externe de YopH purifier in vitro

les protéines effectrices ajoutées in vitro et ensuite trouvées sur la surface de Y. tuberculosis sont fonctionnelles et peuvent être transloquées dans les cellules cibles par un mécanisme SST3 dépendant.

Dosage directe de la translocation des yopH

Démonstration de l'internalisation des effecteurs en utilisant la méthode FRET ( fluorescence energy transfer )

La localisation des Yops à la surface des bactéries n’est pas SST3 dépendant. Les fusions YopH-Bla purifiés sont transporté a l’intérieur de la cellules cible. La translocation des effecteurs ajoutés dans le milieux externe ne s’applique pas exclusivement à YopH.

Sécrétion et translocation Souche MYM Aucune translocation des effecteurs n’a été observer chez les souches MYMΔBD.

des protéines SST3 dépendantes de Y. pseudotuberculosis Sory et al 1995 La translocation des YopH localisées sur la surface des souches de Y. pseudotuberculosis in-vitro nécessite un domaine de translocation qui est distinct du signal de sécrétion. La sécrétion et la translocation peuvent être découplées dans la translocation des protéines SST3 dépendantes de Y. pseudotuberculosis

Est-ce que d’autre système de sécrétion type III ont la capacité à transloquer les YopH localisés a la surface des cellules? Exp: SPI-1 chez salmonella typhimurium

En plus: YopH1-17: pas transloquer. YopH18-49 même % de translocation YopH1-99 . La translocation des YopH par S. typhimurium est dépendante sur le même domaine de translocation que dans les YopH observé dans Yersinia S. Typhimurium peut favoriser la translocation de YopH1-99 ajouté au milieu externe de manière SPI-1 dépendant.

Conclusions et Discussion Les effecteurs ( SST3) localisés sur la surface de Y.pseudotuberculosis peuvent être transportés dans les cellules hotes de façon SST3- dépendante. Caractéristique générale des pathogènes SST3-dépendant YopH , YopE, YopB et YopD (fonctionnels) se trouvent principalement à la surface de la bactérie avant qu’elle n’entre en contact avec une cellule cible. Un modèle de translocation des protéines SST3-dépendant qui précède la translocation polarisé par la formation d’un intermédiaire extracellulaire effecteur/ translocateur. La forme intermédiaire de translocation pourrai être soit : Complexe préformé à la surface de la bactérie Complexe transitoire qui est assemblé dans la membrane plasmique des cellules cibles lors du contact avec la bactérie.

La translocation réelle pourrait être accompli par un système binaire: mécanisme AB-toxine Les acides aminés 18 à 49 de YopH et les domaine hydrophobes des translocateurs YopB et YopD , sont nécessaire a la translocation des fusions YopH-Bla ajoutée a l’extérieur. Le domaine de translocation de YopH joue un rôle dans la translocation SST3-dépendant de cet effecteur en dehors de la bactérie. Les translocateur : IpaB, IpaC et IpaD de Shigella flexini, aussi SipB et SipD chez S. typhimurium se trouvent à la surface de la bactérie mais pas les effecteurs Cela n’exclu pas la présence d’une forme intermédiaire.?

1 2 Une seul étape Deux étapes : Translocateur : Effecteur = Eucaryotic cell Milieux extérieur Eucaryotic cell Bacterial cell Bacterial cell Bacterial cell 1 2 Une seul étape Deux étapes : Translocateur : Effecteur =

Merci de votre attention

Fig. S4. Internalization of YopH1–99-Bla coated Y Fig. S4. Internalization of YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains by HeLa cells. Relative survival of YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains recovered after gentamicin protection assays. Additions of Cytochalacin D (CytD, 0.5 μg/mL) are indicated below the graph. YopH1–99-Bla coated Y. pseudotuberculosis strains: plasmid cured mutant (YPIII + YopH-Bla), yopH-deletion mutant (ΔyopH + YopH-Bla), multiple yop mutant (MYM + YopH-Bla) and an isogenic multiple yop mutant deleted for yopB and yopD (MYMΔBD + YopH-Bla). Data are presented as mean ± SEM of four independent experiments.