Dominique Kerboeuf et Yves le Vern L’apoptose Dominique Kerboeuf et Yves le Vern INRA, IASP, 37380 Nouzilly

I. Définitions et processus

La mort cellulaire 2 types de mort cellulaire : apoptose Nécrose Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD) PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques

Rôles de la mort cellulaire Elimination des « surplus » de cellules saines : Embryologie (cavités, morphogénèse, structures vestigiales, cellules « en trop ») homéostasie = constance de la masse cellulaire processus physiologiques (cellules mammaires, endomètre, cellules épithéliales…) Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…) Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)

Apoptose et Nécrose Se différencient par : Leurs mécanismes et modalités de déclenchement la morphologie des cellules les conséquences tissulaires leurs significations biologiques

Apoptose vs Nécrose Atrophie Intégrité organelles et membrane Condensation du noyau Bourgeonnement de la membrane Fragmentation (« corps apoptotiques ») Phagocytose / C voisines Pas d ’inflammation Turgescence Lyse des organelles et des membranes Pas de condensation Rupture des membranes Libération du contenu cellulaire Lyse de la chromatine Phagocytose tardive Inflammation

Apoptose Nécrose

Photo Molecular Probes

1. Nécrose : membrane et organelles Altérées, noyau + conservé x 10 000 (TEM) 2. Apoptose (A) réarrangement de la chromatine (vs normal N), membrane ++ x 8000 (TEM) 3. Nécrose (SEM) x 5000 4. Apoptose (SEM) bourgeonnements 5. Cellule normale : pores nucléaires x 30 000 (FF) 6. Apoptose : confluence des pores nucléaires x 35 000 (FF)

Remarques Etats intermédiaires : facteurs déclenchants communs importance des ressources énergétiques (ATP) succession apoptose puis nécrose Etat apoptotique « fugitif » inaperçu (phagocytose très rapide)

Un schéma simple : Caenorhabditis elegans 3 étapes : 1) apparition de signaux (externes ou internes) 2) activation de protéases cellulaires 3) formation des « corps apoptotiques » et phagocytose Signal Inactivation Inactivation EGL-1 ----> CED-9 ----> CED-4 ----> CED-3 ----> Apoptose + CED-3 activé Membrane C Etape intra cellulaire

Schéma général de l ’apoptose T cell CD8 TNF Fas Ca ++ NK Conditions physico-chimiques Perforin Granzyme B Bcl2-pro Bcl2-anti Récepteurs de mort Caspase 8 Mitochondrie Dégranulation P53 AIF Cytochrome C Cyclines Caspase 9 Caspases effectrices Caspase 3 (Caspases 6 et 7) ADN, noyau

Les signaux déclencheurs Déclencheurs extra-cellulaires : Souvent communications entre cellules insuffisance de signaux suppresseurs de « PCD » augmentation de signaux inducteurs Déclencheurs intra-cellulaires réponse à des stimuli ou à des perturbations métaboliques

! Combinaison des 2 types de signaux Les récepteurs ont des rôles multiples (ex prolifération, différenciation, survie) Rôle différent du récepteur selon type cellulaire ex. récepteurs des stéroïdes Différents mécanismes d ’induction souvent associés

Insuffisance de signaux suppresseurs Signaux extra-cellulaires Insuffisance de signaux suppresseurs Cultures cellulaires : concentration, sérum, diverses molécules solubles ou liées à la membrane (variations selon le type cellulaire) Liaison cellules cibles ex. neurones = adaptation au nombre de cibles Augmentation de signaux inducteurs Ex = perte queue des têtards = rôle de l ’hormone thyroïdienne

Signaux intra-cellulaires = lésions de la cellule produites par : drogues, toxines, chaleur, radiations, hypoxie, virus… qui ne sont pas des « inducteurs » spécifiques = « seuil de lésions » déclenchement de la PCD = activation des caspases, de protéines proapoptotiques (voie p53 dépendante) ou protéines kinases

Induction in vitro Fas ou Ac anti Fas (CD95) TNF ou ligands du TCR Pas de sérum ou de facteur de croissance UV H2O2 Glucocorticoides Ionophore calcium Camptothecine Contact lymphocytes T cytotoxiques ou NK activés + concentration cellulaire, équilibre de populations Temps nécessaire = 2 à 6 h

Voie Fas-L (CD 95) Fas Fas-Ligand Fas (trimérisation) Pro Cas 8 Cas 8 Membrane cellulaire Fas (trimérisation) FADD Fas Associated protein with Death Domain Pro Cas 8 Cas 8 Pro Cas 3 Autres Cas

Apoptosome m Cytochrome C dATP Pro Cas 9 Cyt C (AIF) Apaf-1 Caspase 9 Apaf-1 Cyt C Pro Cas 9 AIF = Apoptosis Inducing Factor Apaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1

Les caspases = C aspases Cystéines protéases, résidus acide aspartique 14 caspases et pro-caspases 3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammation II= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptose III = 6, 8, 9 ---> «  Activation des caspases « entre elles » = « cascade » irréversible

Rôle très important de la caspase 3 exécuteur-clé (qq soit le stimulus) Régulation de la cascade par des protéines activatrices inhibitrices APAF1 Bcl2 FADD RIP FLASH Bcl2 Activation en présence de : ATP + cytochrome C (rôle de la mitochondrie)

La famille des Bcl2 Action sur les membranes mitochondriales = libération ou non du cytochrome C (proApo ou antiApo) Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid… Mbrane mitochondrie (Bad Bid = cytosol) Bcl2* Bclxl* Bclw Mcl1 Nr13 Al/Bfl1 (*= inhibe Cas9) + formation homodimères ou hétérodimères = régulation

II. Méthodes d’analyse de l’apoptose

* Membranes cellulaires = Translocation des phosphatidylsérines (Annexin V) * Mitochondries = Potentiel de membranes (sondes fluorescentes) = Libération du cytochrome C (Ac ELISA) = Libération de AIF « Apoptosis inducing factor » (Ac ELISA) * Noyau = Clivage de l ’ADN - Ac anti-histones - fragments (180 pb) : gel d ’agarose (« DNA ladder ») - TUNEL ou TdT : extrêmités 3’OH - nucléosomes (ELISA) = Libération des « Nuclear Matrix Proteins » (NMPs) Ac

* Gènes impliqués * Dosages de molécules = Récepteurs des signaux Ac FAS-L (ou Apo-1 ou CD95) TNF = Caspases Ac ou activités enzymatiques (substrats spécifiques) ==> fluorescence) = Protéines régulatrices (pro ou anti) Ac = Glutathion = calcium * Gènes impliqués

Cytométrie en flux et étude de l’apoptose

Principe de la cytométrie en flux Cellule par cellule, quantification de la fluorescence Plusieurs paramètres simultanément pour chaque cellule (jusqu'à 11 paramètres dont 8 fluorescences) Sélection de populations (analyse et tri) Analyse de cellules vivantes, grand nombre en peu de temps

2 types de signaux Signaux de diffusion de lumière diffusion frontale de la lumière = FSC = Forward Scatter diffusion latérale de la lumière = SSC = Side Scatter Signaux de fluorescence couleur d’émission de fluorescence : violet, bleu, vert, jaune, orange, rouge

Spectres d’excitation et d’émission de la fluorescéine Spectre d’excitation Spectre d’émission Invitrogen Molecular Probes

Analyse monoparamétrique : exemple la fluorescence Témoin : autofluorescence des cellules Après marquage spécifique Nombre de cellules par classe d’intensité (« canal ») Intensité de fluorescence verte => échelle exprimée en unités arbitraires ou canaux Population pure => une gausssienne

Analyse biparamétrique : exemple de deux fluorescences double marquage : amélioration de la discrimination entre les populations cellules positionnées en fonction coordonnées sur les 2 axes Population doublement marquée Populations simplement marquées Population non marquée Intensité de fluorescence rouge Intensité de fluorescence verte

Analyse multiparamétrique Sélection des cellules sur les paramètres de diffusion de lumière

Analyse multiparamétrique Marquage avec un anticorps un anti-lymphocytes T Cellules mortes Cellules en apoptose région 1 Cellules vivantes Nombre de cellules par classe d’intensité (« canal ») région 2 Cellules mortes Cellules en apoptose Cellules vivantes Intensité de fluorescence orange

Le tri et ses options Pourquoi trier ? Vérification des analyses Autres analyses (cytométrie ou autre méthodologie) Mise en culture (tri « stérile ») Comment trier ? Une à quatre populations différentes Vitesse de tri maximum 50000 Cellules/s Support : lames, tubes, plaques à microtitration Milieu : « coussin », PBS, RPMI… (+ SVF) La pureté, la viabilité, la stérilité

Principe du tri par cytométrie Buse A Rayon laser Analyse F Drop delay « Break off » Gouttelettes détachées Plaques de déflection - 2500 V + 2500 V

Exemple de tri par cytométrie Analyse avant tri Réanalyse après tri 99.6 % de pureté Drouet-Viard (2001)

Etapes principales de l’apoptose analysées en cytométrie Récepteurs de mort calcium Pro Bcl2 AntiBcl2 membrane Potentiel de membrane mitochondrie récepteurs altérations identification activité caspase Fragmentation « Nuclear Matrix Protein (NMP) noyau

Mise en évidence des récepteurs de mort Fixation ligand spécifique => formation complexe multiprotéique Anticorps dirigés contre les récepteurs de mort fonctionnels : anti Fas (anti CD95) anti TRAIL (anti DR3,DR4,DR5…) anti DCR2, DCR3… => réaction immunofluorescence directe ou indirecte Kyung-Mi Kim et al (2000). Experimental and molecular medicine 32, 246-254.

Mise en évidence des protéines agissant au niveau mitochondrial Anticorps dirigés contre les protéines proapoptotiques: Bax les protéines antiapoptotiques : Bcl2 la forme tronquée de Bid (obtenu après action caspase 8) Perianayagam et al (2003). European Journal of Clinical Investigation 33, 905-911.

Variation du calcium intracellulaire Etape précoce de l’apoptose => augmentation du calcium intra-cellulaire mesure du flux de Ca++ => Fluo3 mesure quantitative du Ca++ : - Fura-2 modification spectre d’excitation - Indo-1 modification spectre d’émission fluorochrome libre : émission 475nm (B) fluorochrome lié : émission 400nm (A) mesure ratiométrique sonde liée/sonde libre Spectre d ’émission de l ’indo-1

Variation de calcium intracellulaire utilisation du fluo-3 Cellules témoins Cellules traitées Vérapamil Induction apoptose par la roténone sur des cellules neuronales Cao QZ et al (2005). World J Gastroenterol Apr 21;11(15):2255-9. WangXJ, Xu JX (2005). Neuroscience Letter Mar 11, 376(2) : 127-32.

Modifications membranaires Modification graduelle de la perméabilité membranaire pénétration plus facile : Hoechst 33342 ou Yo-Pro1 Perte de l’assymétrie membranaire : externalisation des phospholipides AnnexineV reconnaît les phosphatidylsérines Etude du désordre lipidique membranaire externalisation des phosphatidylsérines => modification organisation membranaire => augmentation fixation merocyanine 540 discrimination cellules mortes-cellules vivantes

Externalisation des phosphatidylsérines Cellules mortes Intensité de fluorescence rouge (7AAD) Cellules vivantes Cellules en apoptose Intensité de fluorescence verte (annexine V FITC) Résultats A-M Chaussé (1996)

Externalisation des phosphatidylsérines Lignée de cellules T humaines, coloration annexineV Alexa 488 et Iodure de propidium Photo : Molecular Probes Cellule en nécrose Cellule en apoptose

Modifications dans la mitochondrie Action protéines proapoptotiques (Bax…) Ouverture des pores de transition modification équilibre ionique : dépolarisation de la membrane mitochondriale libération cytoplasmique du cytochrome c libération cytoplasmique des protéines SMAC/Diablo libération cytoplasmique des AIF

Mise en évidence de la dépolarisation de la membrane fluorochromes cationiques et lipophiles incorporation potentielle dépendante => variation du potentiel mitochondrial exemple : DiOC6, Rhodamine 123, MitoTracker, JC-1… mitochondries fonctionnelles = multimères => fluorescence rouge mitochondries non fonctionnelles = monomères => fluorescence verte JC-1 Cellules normales Cellules en apoptose Intensité de fluorescence rouge Cellules mortes D’après Salvioli S. et al. (2000) Cytometry 40:189_197 Intensité de fluorescence verte

Incorporation d ’un fluorochrome cationique : le JC-1 Coloration d ’une lignée de fibroblastes au JC-1, différents temps de stimulation de l ’apoptose Photo : Ildo Nicoletti, Perugia University Medical School.

Mise en évidence de la libération cytoplasmique du Cytochrome C Anticorps dirigés contre le Cytochrome C + Act D -Act D Coloration d’une lignée de cellules T humaines Photo et Histogramme : Merck Novagen

Activité enzymatique des caspases ===> forme active : anticorps site actif de l’enzyme : Peptide spécifique (FLICA) quantification de l’activité enzymatique Procaspases précurseurs inactifs Caspases actives Caspase active Substrat non fluorescent produit fluorescent

Exemple de mesure de l’activité enzymatique monoparamétrique activité caspase biparamétrique : activité caspase et ploïdie Quantité d ’ADN (Iodure de Propidium) Cellules en apoptose Activité caspase (FITC) F. Guérif, V. Cadoret et D. Royère (2001)

Fragmentation de l ’ADN En fin de cascade apoptotique il y a activation de nucléases qui coupent l ’ADN entre les nucléosomes méthode TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling méthode du pic hypodiploïde :

Méthode TUNEL Enzyme Tdt fixe des désoxynucléotides non fluorescents ou fluorescents sur l’extrémité 3’OH libre. Cellule en apoptose Cellule en nécrose Photo Molecular probes

Méthode TUNEL Utilisation de la ChromaTide BODIPY FL-14-dUTP apoptose en cours => fluorescence verte apoptose terminale : fragmentation nucléaire intense => fluorescence jaune Photo : Zbigniew Darzynkiewicz, Cancer Research Institute, New York Medical College.

Méthode du pic hypodiploïde coupure entre les nucléosomes => quantité ADN < 2C quantification ADN avec un fluorochrome intercalant spécifique (Iodure de propidium, Bromure d’éthidium…) Cellules normales Cellules en apoptose Nombre de cellules par classe d ’intensité (« canal ») Pic G2/M Pic G0/G1 Intensité de fluorescence rouge (Iodure de Propidium) Résultats M. Afanasieff (1993)

III. Apoptose et Infectiologie

Pathologies associées à l ’apoptose Apoptose excessive Alzheimer Parkinson SIDA Hépatites Certains diabètes Malformations Rejet de greffe virus, bactéries Toxines Apoptose insuffisante Maladies autoimmunes Leucémies Syndromes lymphoprolifératifs Tumeurs Ostéoporose Malformations Rejet de greffe Maladies virales (poxvirus, adenovirus) Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)

Trois exemples d’apoptose en pathologie infectieuse Mort du macrophage infecté par des salmonelles Rôle de l’apoptose dans les relations Plasmodium-vecteur Virus et régulation mitochondriale de l’apoptose

A) Salmonellose K. HUEFFER and JE Galan, Cell. Microbiol Co-évolution pathogène-hôte = modulation des relations (ex. fonctions/mort macrophage)

Les TTSS de Salmonella Salmonelles  2 « Type III protein secretion system » ou TTSS SPI-1 : stimulée par faible O2 et forte osmolarité = phase d’invasion intestinale SPI-2 : stimulée par faible Mg++ et pH acide (intra-cellulaire) = infection systémique Les 2 protéines induisent la mort du macrophage mais différents mécanismes et temps : 45 min (SPI-1 ?) ou 24 h (SPI-2 ?)

Les questions S’agit-il d’une PCD ou d’une nécrose ? Mécanisme typique de PCD ? Mort identique pour tous les macrophages ? Conséquences pour le pathogène et pour l’hôte ?

PCD ou nécrose ? témoins - fragmentation chromatine - activation caspase 3 - nucléosomes dans cytoplasme - perte intégrité membrane - pas d’activation caspase 3 - altération des organites apoptose nécrose

Mécanisme typique de PCD ? Rôle clé de la Caspase 1 Inhibiteurs de caspases inactifs Cytotoxicité courte ou longue Pas d’activation de la caspase 3 Différences selon les macrophages Existe sans Caspase 1 Action de protéines effectrices délivrées par TTSS ? Régulation pro ou anti-apoptotique ? Action indirecte (ex dégradation de l’actine Conclusions = apoptose par différents mécanismes

Conséquences Stimulation du PCD / salmonelles pour limiter la réaction de l’hôte ? Réponse de l’hôte pour limiter l’invasion bactérienne ? Souris caspase-1- sont plus résistantes = moins pénétration des salmonelles dans la muqueuse ?

B) le Plasmodium et son vecteur H. Hurd and V B) le Plasmodium et son vecteur H. Hurd and V. Carter, 2004, Int J Parasitol., 34, 1459-1472

Les observations PCD chez le parasite, le vecteur et l’hôte - Chez le parasite et chez le vecteur : * images caractéristiques de PCD * blocage par les inhibiteurs de caspases des métazoaires - Chez l’hôte : * liaison présence du parasite et mort CD4+ et CD8+ ( du Fas)

PCD chez le parasite Pas d’homologues de caspases dans le génome  autres cystéine protéases ? = «méta » et « para » caspases dont calpaine, cathepsine Différences pour l’étape mitochondriale (pas de p53, AIF, Apaf1 et Bcl2) Ressemblances pour les signaux inducteurs Heat shock, médicaments, lectines (con A), sérum, ROS, NO (moustique et hôte producteurs +++)

PCD dans le tube digestif du moustique (1) Pas un type cellulaire précis Ensemble de caractéristiques communes post-invasion parasitaire (très lié à la chronologie du cycle et du stade parasitaire) Présence de caspase-3 like Déclenchement par simple contact parasitaire = élimination des cellules endommagées et/ou libération du parasite ? Le parasite s’échappe intact alors que sensible aux inducteurs et présence de NO (= seuils ?)

PCD chez le moustique (2) Réduction de fécondité du moustique / le parasite ( mRNA de vitellogénine) et PCD cellules folliculaires (reversible avec inhibiteur de caspase) = Réponse adaptative du vecteur vs stress de son parasitisme ? Un stress physiologique à la fois ? = Optimisation par le parasite de la survie de son hôte pour sa propre maturation ? Intérêt à « ménager » l’hôte

C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie P. Boya et al C) Virus et modulation de PCD dans la mitochondrie P. Boya et al., 2004, Biochem. Biophys. Acta, 1659, 178-189 Virus peuvent 1) augmenter PCD (dissémination, immunosuppression); 2) réduire (réplication) Variation selon les familles de virus Différentes voies d’action sur PCD (TNF, PKR, P53, caspases, mitochondries)

=> Voie externe : « death receptors », caspases, MMP) Mitochondries => action « MMP », (Mitochondrial Membrane Permeabilisation) = point central clé Virus avec : 1) induction; 2) inhibition de MMP (début du cycle) (fin du cycle infectieux) MMP déclenchée par : => Voie externe : « death receptors », caspases, MMP) => Voie interne : action directe mitochondriale « mitochondrial targeting sequence = MTS)

Mécanismes anti-apoptotiques Exemple du KSHV (herpes virus : sarcome de Kaposi’ et maladies lymphoprolifératives) Différentes protéines virales anti-PCD dont 2 localisées dans mitochondries (K7 et K15) K7 contient un MTS K7 bloque MMP induit par TNF-α, CD45 death receptor ligand, Bax… K7 a un domaine formant un pont Bcl-2 et caspase 3 activée K7 régule aussi la voie du calcium

Antiapoptotic viral proteins acting at the mitochondria Virus Protein Intracellular Localization Partners Cellular homologs Protects cells from CMV vMIA M Bax, ANT Oxidants, anti-Fas, Bax, tBid, TN, TG, STS, BFA, NFX, CPX, HCQ Myxoma M11L PBR STS, anti-Fas, PPIX Vaccinia F1L STS, anti-Fas KSHV K7 or vIAP M, ER, PM CAML, Bcl-2, activated caspase 3 Survivin delta-Ex3 TG, TNF-α, anti Fas K15 M, ER HAX-1 EBV BHRF1 Bcl-2 TRAIL, t-BHP, DNA damage, virus infection HCV NS2 ER (M with CIDE-B) CIDE-B

Mécanismes pro-apoptotiques Exemple du HBV (hépatite B) : Protéine X (HBx) Essentielle pour réplication virale, oncogène Sensibilisation des hépatocytes au PCD induit par # stimuli (TNF-α, TRAIL) Localisation mitochondriale, perte du ΔΨm, mort MTS identifiée et fonctions précisées HBx interagit avec 2 protéines mitochondriales (HSP60 et VDAC3) Protéines anti-PCD (Bcl2 et Bcl-Xl) protègent VDAC3 = rôle pathogène (hépatite chronique et carcinogénèse) ???

Proapoptotic viral proteins acting at the mitochondria Abbreviations: AEV, avian encephalitis virus; ANT, adenine nucleotide translocase; BLV, bovine leukemia virus; C, cytosolic; ER, endoplasmic reticulum; FPPS, farnesylpyrophosphate synthetase; HBV, hepatitis B virus; HIV-1, human immundeficiency virus-1; HPV, human papillomavirus; HSP, heat shock protein; HTLV-1, human T leukemia virus-1; IAV, influenza A virus; M, mitochondria; N, nucleus; VDAC, voltage-dependent anion channel; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus

Séquences en relation avec l’apoptose

Quelques sites web intéressants 1) Généralités sur l ’apoptose : http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TOC.html voir « apoptosis » 2) Fournisseurs : Molecular Probes : sondes fluorescentes http://probes.invitrogen.com/handbook/ Roche www.roche-applied-science.com voir « cell biology » puis « apoptosis » Genentech : www.researchApoptosis.com Merck : http://www.merckbiosciences.co.uk/html/emd/ip_apoptosiskits.html

Notre adresse E-mail : Site web : Laboratoire de Cytométrie Unité Infectiologie Animale Santé Publique (IASP-213) Centre de Tours tél 02-47-42-77-59 Dominique Kerboeuf, Yves Le Vern E-mail : kerboeuf@tours.inra.fr levern@tours.inra.fr Site web : http://www.tours.inra.fr/plates_formes/plate_forme_d_analyses_cellulaires_et_moleculaires