Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN Projet I Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN

Objectifs Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo) Générer une carte théorique (Bioinfo) Vérifier expérimentalement la carte Déterminer l’orientation

Cartographie des plasmides inconnus Vecteur pUC19

Clonage dans pUC19 SCM X Digéré avec X

Clonage dans pUC19 + Insertion X

Déterminer le site d’insertion + Insertion X Couper avec X

X Delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite

Déterminer l’orientation relative X A X Orientation 2 A X A X

Mutagenèse dirigée de LacZ Projet II Mutagenèse dirigée de LacZ

Objectifs Utiliser le PCR pour faire l’amplification et la mutagenèse du gène Lacz dans pUC19 Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour permettre le clonage

Réplication & Amplification d’ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne

Polymérases Amorce -OH Extrémité 3’OH Polymérase 5’…GTACT 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG Matrice d’ADN ou ARN

2 Types de Polymérases ADN: ADN dépendante : Requiert une matrice ADN Fait la synthèse d’ADN Ex. Polymérase Taq ARN dépendante Requiert une matrice ARN Fait la synthèse d’ADN (ADNc) Ex. Transcriptase inverse

La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCR Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 14

PCR-1ier Cycle <3’GGAACGGTACCGT5’ Dénaturation (95oC) Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’>

5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ Extension (72oC) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 3’ 5’ --------------------------------  ----------------------------------  5’CCGTGGGGT3’> 16

PCR-2e Cycle 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- 5’ 3’ 3’ 5’ ---------------------------------- -------------------------------------- Dénaturation -------------------------------  ----------------------------------  Appariement /Extension --------------- ----------------

PCR- Cycles Subséquents Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2n fois -------------------- ------------------- ------------------------ ------------------------ ------------------------ 32 fois totale

Survol des Cycles du PCR Amorces: Courte séquence de nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles 15-30 nucléotides Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices

Survol des Cycles du PCR Appariement: Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier Habituellement entre 55-75oC

Survol des Cycles du PCR Extension: Fait à la température optimale pour la polymérase ADN Habituellement 72-75oC pour la polymérase Taq

Polymérase Taq Isolé d’une bactérie thermophile Thermus aquaticus Stable à des températures élevées 95oC - utilisée pour dénaturer l’ADN Aucune activité exonucléase Pas d’autocorrection Possède une activité deoxynucléotidyl transférase Activité polymérase indépendante d’une matrice Ajoute dA aux extrémité 3’OH libres

Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt Établis le point d’initiation de la réplication Établis le point de terminaison de la réplication 23

Conception d’Amorces Autocomplémentarité: Complémentarité de la paire 5’GGGGCCCC3’ G C Complémentarité de la paire 5’GGGGAAAA3’ 3’CCCC TTTT5’ 24

Conception d’Amorces Complémentarité 5’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice CCATAACCGG-OH3’ 5’CGA Complémentarité 3’ 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ Matrice TACCCATAACC TA-OH3’ 25

Conception d’Amorces 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ Région d’intérêt 3’ Bonne orientation Mauvaise orientation 26

Problème 5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’ Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 27

Utilité du PCR Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relative Entre 100pb et 10Kpb Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêt Présence ou absence d’un produit d’amplification Mutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 28