Confirmation microbiologie des cas d’Ulcère de Buruli Cours International Centre Pasteur du Cameroun Yaounde, 23-30 janvier 2006 F. Portaels

Confirmation microbiologique des cas d’Ulcère de Buruli I. Pourquoi ? 1. En zone d’endémie: augmenter la qualité du diagnostic clinique confirmer la qualité des excisions chirurgicales confirmer des cas d’échecs, de rechutes confirmer l’efficacité d’éventuels traitements antimycobactériens analyser les souches de M. ulcerans 2. En zone non endémique confirmer la présence de l’UB

II. Comment ? Examen direct Culture PCR Histopathologie Un vrai cas d’UB est confirmé par au moins 2 résultats positifs (OMS, 2001) N.B. Pour les centres qui ont une excellente expérience dans le diagnostic clinique de l’UB un seul résultat positif pourrait suffir.

III. Recueil des échantillons 1. Formes non ulcérées Echantillons prélevés à partir des tissus excisés chirurgicalement. Prélever au centre du tissu excisé (ex: graisse nécrosée) Placer les fragments de tissus (2  4 mm3) dans le milieu de transport (MT) Enfoncer au fond du MT (Le MT doit complètement entourer le f’ragment)

2. Formes ulcérées 2.1. Ecouvillons Ecouvillonnages multiples sous les bords décollés de l’ulcère (la répartition des bactéries peut être très hétérogène) Ne pas écouvillonner le centre de l’ulcère 2.2. Tissus prélevés à partir d’une excision chirurgicale cf. formes non ulcérées

3. Formes osseuses 3.1. Diagnostic microbiologique Uniquement dans des centres de référence. Produits de curetages, fragments d’os, “gelée” à placer dans le milieu de transport (cf. les autres formes).

3.2. Facteurs de risque d’atteinte osseuse I. Facteurs microbiologiques 1. Charge bacillaire des lésions cutanées à l’examen anatomo-pathologique: patients avec atteintes osseuses: 95.8% Z+ patients sans atteintes osseuses: 52.4% Z+ 2. Rôle des germes de surinfection (staphylo, strepto)? NEANT !

3. La virulence des souches pourrait jouer un rôle important. Souches africaines: les plus virulentes  atteintes osseuses Souches australiennes, américaines: moins virulentes  pas d’atteintes osseuses 4. Survie à 37°C des mycobactéries isolées des os? NON ! Les souches des os survivent moins bien “in vitro” à 37°C que celles de la peau! Les souches des os poussent moins bien “in vitro” à 33°C que celles de la peau!

Analyses microbiologiques Culture positive Examen direct lésion cutanée lésion ossseuse 4+ 16/17 (94.1%) 5/12 (41.7%) 3+ 7/13 7/13 2+ 5/12 4/11 1 2/8 1/12 - 3/11 6/22 Total 33/61 (54.1%) 23/70 (32.9%)

Facteurs de risque d’atteinte osseuse II. Facteurs liés à l’hôte 1. Le délai à la consultation joue un rôle primordial! médiane pour patients sans atteinte osseuse: 46 jours médiane pour patients avec atteinte osseuse: 91 jours 2. Présence d’une ancienne cicatrice guérison naturelle guérison après traitement traditionnel 3. Infection par le VIH 4. Autres maladies (schistosomiase, drépanocytose, … ) 5. Autres facteurs (génétiques? immunitaires?

IV. Positivité des tests en fonction des formes cliniques (cas définis par au moins 2 tests positifs) Résultats de Zagnanado (Benin) Formes Nombre de cas positifs (%+) cliniques ZN Culture PCR Histopathologie Nodule 20 (62.5) 16 (59.3) 29 (93.5) 18 (94.7) Oedème 4 (80.0) 4 (80.0) 6 (100.0) 3 (100.0) Plaque 268 (82.7) 201 (83.4) 314 (98.8) 79 (98.8) Ulcère 125 (72.3) 91 (65.9) 167 (98.7) 83 (94.3) Os 24 (63.2) 7 (20.6) 38 (100.0) 24 (85.7) Forme mixte 274 (85.1) 201 (75.0) 306 (98.7) 98 (96.1) Ulcère en voie de guérison 20 (74.1) 15 (78.9) 26 (100.0) 3 (100.0) Autres - 1 (50.0) 2 (100.0) - TOTAL 735 (79.6) 536 (73.0) 888 (98.7) 308 (95.1) Formes ulcérées vs formes non p=<0.001 0.004 NS NS ulcérées

V. Nombre d’échantillons à prélever par patient Résultats de Zagnanado (Benin) Nombre Nombre de cas % cas d’échantillons confirmés par au confirmés moins 2 tests+/total 1 375 / 797 47.1 % 2 277/410 67.6 % 3 87/112 77.7 % >4 156 / 180 86.7 %

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. Patient n° Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose 1 1 - - - - - 2 - - - - - 3 - + - + + 4 - - - - - 5 + + - + + 2 1 + + - + - 2 + + - + + 3 + + - + + 4 + + - + + 6 + + - + + 7 - + - + +

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite) Patient n° Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose 3 1 + + + - + 2 + + - - + 3 + + - - + 4 + + - - + 5 - + - - + 6 - + - - - 7 + + - - + 8 + + + - + 9 + + + - + 4 1 - - - - + 2 - + + + + 3 - + + - + 4 - - - - - 5 + + - + +

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite) Patient n° Fragment Histopathologie de tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose 5 1 + + + + + 2 - + + + + 3 + + + + + 4 - + + - + 5 - + - + + 6 1 - - - - + 2 - + - - - 3 + + + - + 4 + + + + + 5 - + + - - TOTAL 19 30 12 16 18 %+ 52.8 83.3 33.3 44.4 77.8

Distribution hétérogène des bacilles: résumé Nombre de biopsies punch positives pour 2 tests chez 6 patients Patient n° Nb+/total %+ 1 2/5 40 2 6/7 86 3 8/9 89 4 3/5 60 5 5/5 100 6 3/6 50

VII. Quelques questions Q1 VII. Quelques questions Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ?

Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas. R1. - Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ? R1. - Oui, pour éviter un diagnostic erroné (faux positif, faux négatif) - Néanmoins: risque de ne pas pouvoir confirmer une forme paucibacillaire (ex: ulcère avec granulome)

Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction des formes cliniques ?

Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction des formes cliniques ? R2 Oui - ZN et culture plus fréquemment positifs pour les formes non ulcérées - PCR et histopathologie: pas de différence

Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ?

Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir. R3 Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ? R3 * la PCR IS2404 en premier choix car: - sensibilité de 93.5% à 100% suivant les formes cliniques - peut être appliqué à des écouvillonnages - peut être appliqué sur des échantillons conservés dans l’alcool - test compliqué, coûteux - nécessité d’un laboratoire bien équipé - risques de faux positifs (matériel à usage unique indispensable) * l’histopathologie car - sensibilité de 84.3% à 100% - importante pour les formes paucibacillaires - peut fournir un diagnostic différentiel

Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour confirmer un diagnostic d’UB ?

Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour confirmer un diagnostic d’UB ? R4. Au moins 2 échantillons car: - distribution hétérogène des bacilles - augmente la positivité des patients

VIII. Conservation et transport des échantillons 1. Analyse immédiate: récipient stérile sans additif 2. Echantillons à transporter 2.1. Analyse dans les 24 heures garder à +4°C ou au froid dans un “frigo-box” (avec glace) 2.2. Au-delà de 24 heures (cas le plus fréquent) utiliser un milieu de transport (MT) garder les MT à +4°C jusqu’au moment de l’envoi

IX. Milieu de transport semi-solide (SEMI) 1. Composition Middlebrook 7H9 + PANTA (Becton-Dickinson) (Polymixine B, Amphotéricine B, acide Nalidixique, Triméthoprime, Azlocilline) + 0.5% agar 2. Avantages Transport à t° ambiante Contrôle des contaminations (PANTA) Survie de M. ulcerans pendant longtemps (> 1 mois) Remarque: ce n’est PAS une raison pour laisser traîner les échantillons ! Survie des autres mycobactéries (M. tuberculosis, M. chelonae)

3. Nos résultats après transport dans le SEMI Cultures positives à partir d’échantillons des pays suivants: Bénin Côte d’Ivoire République Démocratique du Congo Angola Papouasie-Nouvelle Guinée Australie PCR, séquençages positifs pour M. ulcerans à partir des échantillons (négatifs en culture) des pays suivants Soudan Ouganda Pérou

X. Diagnostic microbiologique de l’UB Comparaison des résultats de 2 laboratoires: 1. Le Laboratoire de Référence des Mycobactéries (LRM) de Cotonou (Prof. S. Anagonou et Dr. D. Affolabi) 2. L’Institut de Médecine Tropicale (IMT) d’Anvers (Prof. F. Portaels)

1. Matériel et méthodes Patients cliniquement suspects d’UB Fragments de tissus prélevés lors des excisions Chaque fragment est coupé en 2 - un morceau pour le LRM - un morceau pour l’IMT Chaque morceau est placé dans le milieu de transport Conservation à +4°C jusqu’au moment de l’envoi

2. Résultats 2.1. Examen direct LRM: Auramine + : 234/359 = 65.2% IMT: Ziehl + : 179/359 = 49.9% IMT + - + 158 76 234 LRM - 21 104 125 179 180 359 Coefficient kappa: 0.46

Cultures positives sur LJ / total non contaminé LRM: 90/233 = 38.6% IMT: 101/233 = 43.3% IMT + - + 65 25 90 LRM - 36 107 143 101 132 233 Coefficient kappa: 0.46

Contaminations LRM: 77/404 = 19.1% IMT: 63/404 = 15.6%

3. Comparaison LRM-IMT: conclusions La coloration à l’Auramine donne de meilleurs résultats que le Ziehl (65% vs 50%) La positivité des cultures est comparable (39% vs 43%) La concordance est moyenne  hétérogénéité des tissus ! Taux de contaminations légèrement plus élevés au LRM qu’à l’IMT (19% vs 16%) MAIS: LRM: hotte aspirante au moment de l’étude! Maintenant: flux laminaire !

 Le transfert de technologie est réussi: Le LRM est un excellent laboratoire pour la confirmation microbiologique des cas d’UB par examen direct et par culture

XI. Analyse des échantillons négatifs par examen direct, culture et PCR UB confirmé sur des échantillons antérieurs UB non actif ou guéri Infections secondaires Autres: 12 / 404 = 3% plaques: 5 nodules: 3 ulcères: 3 tuméfaction: 1

XII. L ’ulcère de Buruli dans un centre de santé rural au Bénin Mycobacterium ulcerans Disease (Buruli Ulcer) in Rural Hospital, Southern Benin, 1997-2001 Debacker et al. Emerg Infect Dis 2004; 10: 1391-1398

CSNG Zagnanado Le Centre Sanitaire et Nutritionnel Gbemoten (CSNG) Premier cas traité en 1977 aujourd’hui: plus de 4000 patients

L’étude 1700 patients UB admis entre 1997-2001 autres affections:13 patients rechutes: 57 patients (3.3%) 1630 patients UB pour l’analyse

1630 patients 13 patients: confirmation d’une maladie autre que l’UB abcès à M. chelonae: 4 tuberculose cutanée: 5 diphtérie cutanée : 1 mucormycose: 2 ostéosarcome: 1

% positivité des examens de laboratoire en fonction des formes cliniques Forme Ziehl+ Cult+ PCR+ Histo+ ulcère 65.2 63.0 96.3 96.4 nodule 45.8 56.5 91.3 95.0 oedème 66.7 50.0 100 100 plaque 81.9 75.2 96.7 100 os 64.5 28.0 100 92.0 formes mixtes 79.7 74.2 97.1 95.8

XIII. Pourquoi les échantillons sont-ils négatifs ? 1. C’est un vrai cas d’UB ! le choix du fragment n’est pas bon: - trop superficiel (ex: Guinée) - tissus prélevés en dehors des lésions nécrosées tissus trop contaminés - lors du prélèvement - pendant le transport (tissus non enfoncés au fond du milieu de transport) lésions en voie de guérison, en voie de cicactrisation erreurs de n°s, erreurs au laboratoire

2. L’UB est présent dans la région mais ce n’est pas un cas d’UB ! Autres affections cf diagnostic différentiel (guide à l’usage des professionnels de la Santé) 3. L’UB n’est pas présent dans la région

XIV. Quelques derniers conseils 1. Demander au chirurgien de prélever lui-même les tissus nécrosés. Les placer dans un récipient stérile (plateau ou boîte de Pétri) 2. Prélever plusieurs échantillons (au moins 2) par patient (répartition hétérogène des BAAR dans les lésions) 3. Marquer les n°s sur les boîtes de Petri et milieux de transport au crayon ou stylo à bille sur un sparadrap (les marqueurs s’effacent à l’humidité !). 4. Prévoir un flacon avec formol pour l’histopathologie (très important pour le diagnostic différentiel)

XIV. Quelques derniers conseils (suite) 5. En routine, faire d’abord un examen direct (ED) 6. Si ED négatif → PCR recommandé 7. Culture: peu sensible surtout pour les lésions osseuses. Importante pour l’évaluation des traitements antimycobactériens, pour la recherche (empreintes génétiques).