L’électrophorèse des protéines sur gel d’acrylamide SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Électrophorèse monodimensionnelle La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été décrite par Ulrich Laemmli en 1970. C'est l'une des techniques (et donc l'un des articles) les plus cité(e)s dans la littérature scientifique :Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature 227, 680 - 685 .

principe L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique. Cette technique permet, entre autre, de : déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective d'évaluer le degré de purification d'une protéine de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps) de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en protéomique), selon 2 paramètres : point isoélectrique (isofocalisation) puis masse molaire

1ère étape: Préparation de l’échantillon    On fait bouillir un mélange de protéines dans un tampon Tris-glycine en présence : d'un agent réducteur : le b-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures.  d'un détergent ionique fort : le sodium dodecyl sulfate (SDS) qui enveloppe les chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives. Ces charges se repoussent et déplient les chaînes polypeptidiques. En conséquence : les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native  les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique

2ème étape: Préparation du Gel d'électrophorèse C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation : d'acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui ponte les chaînes d'acrylamide . La réaction de polymérisation est : initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium catalysée par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane - toxique)  

Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées. En conséquence :  plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer  une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant moins que sa masse molaire est élevée Pourcentage d'acrylamide Gamme de séparation en kDa 7,5 45 - 400 10 22 - 300 12 13 - 200 15 2,5 - 100

2ème étape: Préparation du Gel d'électrophorèse  Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support et un peigne est enchâssé entre ces plaques.  Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant ainsi des puits.  La taille et le nombre des dents des peignes sont variables ce qui permet de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL d'échantillon de protéines à séparer.  Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans une cuve d'électrophorèse.  Du tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis dans la cuve

Séparation des protéines 3ème étape: séparation des protéines en conditions dénaturantes  Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans les puits.  la migration s'effectue sous l'action d'un champ électrique :voltage : 100 V - 150 V (16 à 20 mA pendant 1 heure) Séparation des protéines

 Après migration, le gel est démoulé.  Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.  Les protéines sont révélées par une coloration : par exemple avec le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible).   On obtient différentes bandes pour chaque piste de la figure ci-contre (la flèche indique le sens de migration). La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des protéines standards de masses molaires connues (piste de droite).

anhydrase carbonic(29 kDa) Exemple de marqueurs : myosine (205 kDa) b galactosidase (116 kDa) phosphorylase b (97,4 kDa) albumine (66 kDa) ovalbumine (45 kDa) anhydrase carbonic(29 kDa) Source : E. Jaspard (2004)

détermination de la masse molaire d’une protéine La mobilité relative est le rapport : distance de migration d'une bande distance de migration du front de migration   La droite : log (masse molaire) = f(mobilité relative) permet de déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue.

Électrophorèse bidimensionnelle 1ère étape: séparation des protéines en fonction de leur charge:  L’échantillon est dissous dans une solution contenant de mercaptoéthanol (détergent non ionique) et l’urée (agent dénaturant) cette solution solubilise, dénature et dissicie les chaines polypeptidiques sans modifier leur charge.  L’électrophorèse des protéines se fait dans un tube étroit de gel de polyacrylamide, où un gradient de PH est établi  Chaque protéine migre vers la position du gradient correspondant à son point isoélectrique et s’y immobilise: focalisation isoélectrique. À PH élevé la protéine est chargée négativement À bas PH la protéine est chargée positivement

2ème étape: séparation des protéines en fonction de leur taille:  Le gel étroit est plongé dans le SDS, puis placé au bord d’un bloc de gel de polyacrylamide-SDS  Chaque chaine polypeptidique migre pour former une tache séaprée.

technique d’immunoblotting Elle permet de déterminer les caractéristiques des antigènes protéiques sur des extraits : - leur présence, - leur quantité dans les préparations analysées - leur poids moléculaire en se référant à des marqueurs de poids moléculaires connus.

Elle comporte 6 étapes : 1° Etape : Préparation de l’échantillon 2° Etape : Séparation des protéines par électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide 3° Etape : Transfert des protéines du gel vers la membrane 4° Etape : Blocage des sites de liaisons non spécifiques sur l’immunoblot 5° Etape : Addition de l’anticorps : Ac I 6° Etape : Ac II, Détection du complexe Ag-Ac

étape 3: Transfert des bandes protéiques sur une membrane de nitrocellulose L’étape 1 et l’étape 2 ont été déjà étudiées au cours du SDS-PAGE Feuille de nitrocellulose ou de nylon chargé ou non Gel  Transfert humide  Transfert semi-sec

préparation du Transfert des bandes protéiques sur une membrane de nitrocellulose Présentation du gel après migration des protéines Préparation du transfert Feuille de nitrocellulose Gel Papier Whatman

Transfert humide Gel Appareil Biorad Gel Feuille de Feuille de Papier Whatman Gel Feuille de Nitrocellulose Papier Whatman Feuille de Nitrocellulose Gel Appareil Biorad

Transfert humide Electrode + Electrode - Tampon Tris Glycine Gel Membrane Papier filtre Support Electrode + Electrode - Tampon Tris Glycine 25 mM Tris, 190 mM Gly pH 8. Transfert 3 h à 150 mA 2,5 mA/cm2 Appareil Biorad Transfert toujours sous tension

Transfert semi-sec Vis de serrage Papier filtre cathode - Gel Membrane Papier filtre anode + Support Transfert 30 mn 2,5 mA/cm2 Vis de serrage Appareil de transfert semi-sec Appareil Millipore

Préparation du transfert

Appareil de transfert semi-sec sous tension

Coloration optionnelle de l’immunoblot (visualisation des protéines) Détermination du poids moléculaire des Ag en comparant sur un puits voisin la migration des marqueurs de PM connu. Nitrocellulose : Rouge ponceau - coloration labile - décoloration avec Na Cl 90/00

Étape 4: Blocage des sites de liaisons non spécifiques Blocage avec des protéines : poudre de lait 5%, BSA 3%. Traitement par des solutions détergentes : Tween 20 0,2%.

Incubation avec l’anticorps primaire Étape 5: Addition de l’anticorps primaire après décoloration de la feuille Incubation avec l’anticorps primaire

Étape 6: Addition de l’anticorps secondaire couplé au traceur Ig de chèvre dirigées contre les Ig de lapin (Ces Ig de chèvre sont couplées au traceur exp: la peroxydase) Anticorps primaire produit chez le lapin

soit : - au DAB - au 4-Cl 1-N - à l’ECL Etape 7 : Révélation anticorps primaire et secondaire couplé à une enzyme le plus souvent -par colorimétrie(La concentration de protéine est évaluée par densitométrie, évaluation de l'intensité de la bande ou par spectrophotométrie). -par chimiluminescence (la +sensible) ECL -par autoradiographie -par fluorescence soit : - au DAB - au 4-Cl 1-N - à l’ECL Limite de détection : 1 à 10 ng de protéine

Étape 7:Révélation de l’activité de la péroxydase par le DAB (oxydé)

Détection à l’ECL Chimioluminescence On ajoute sur le blot un mélange contenant H2O2, le substrat luminol et un enhancer (activateur). La PO agit comme un catalyseur pour l’oxydation du luminol. Ce luminol oxydé émet des photons qui vont impressionner l’Hyperfilm-ECL, un film photosensible ou une caméra (voir appareil suivant). Travailler en cassette dans le noir

Étape 7:Révélation de l’activité PO

PO Luminol oxydé H2O2 Photons Détection à l’ECL Bilan final: révélation de l’activité PO (péroxydase) PO Luminol oxydé H2O2 2H2O O2 + Luminol Enhancer 2- Photons Hyperfilm ECL Ou caméra

Détection à l’ECL Appareil Genegnome commercialisé par Syngene

Détection à l’ECL PC Caméra Immunoblott

Détection à l’ECL Extraits protéiques de cerveau de souris adulte

Avantages de l’ECL Western blotting Haute sensibilité (10 fois plus sensible que les méthodes colorimétriques) Détection rapide 10 s à 1 mn pour un film, 5 à 10 mn pour la caméra Faible bruit de fond Quantification possible avec une caméra