Groupe par 2 étudiant(e)s 3 heures Séparation des acides aminés par chromatographie sur papier et séparation des pigments par chromatographie sur colonne Groupe par 2 étudiant(e)s 3 heures Unité de de Pratique de la chimie médical 2017

Chromatographie couleur figure Chromatographie sur papier carotène xanthophylle papier Chlorophylle A éluant Chlorophelle B Chromatographie sur papier Ligne de dépôt

Classification des méthodes chromatographiques Chromatographie sur colonne Chromatographie planaire Sur papier （CP） Sur couche mince （CCM）

Chromatographie gazeuse GC Column de GC 蛋白质组学: 利用HPLC 分离蛋白质 HPLC在《中 国药典》中作 为药物主要检 测手段 Chromatographie liquide en haute performance HPLC Column de HPLC

Applications Purification des extraits naturels Détermination des agents de nutrition ou de additions dans aliments Purification des produits synthétiques

一、Objectives 1 Bien comprendre le principe et l’application de chromatographie sur papier 2 Maitriser la manipulation de chromatographie sur papier et le calcul de valeur de Rf 3 Bien comprendre le principe et l’application de chromatographie sur colonne 4 Maitriser la manipulation de chromatographie sur colonne

二、Principes 1.Description générale Phase mobile ajouté dans la tête de colonne Mélange à séparer dissout dans la phase mobile 1.Description générale La chromatographie est une technique dans laquelle les constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesse auxquelles ils sont entraînés à travers une phase stationnaire par une phase mobile gazeuse ou liquide. Constituants séparés Phase stationnaire Colonne en verre Les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition des solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire. Chaque Constituant séparé est collecté à la fin de la colonne

séparation identification dosage 2. Objective de la technique chromatographique séparation identification dosage

3. Le facteur de rétention Rf Le facture de rétention (ou Rapport frontal) est un paramètre expérimental qui permet de comparer les vitesse de progression des solutés dans la phase stationnaire. Le Rf est caractéristique d’une molécule pour un éluant et un support donnés. Front du solvant Spot d’un échantillon   Ligne de dépôt Signification: identification des composés par comparer le Rf

三、procédure 1. Chromatographie sur papier Dépôt des échantillons développement Révélation calcul 2. Chromatographie sur colonne Dépôt d’échantillon élution Collecter des fractions Préparation de la colonne

Dépot des échantillons 1. Séparation des acides aminés sur papier Dépot des échantillons Prendre une papier chromatographique, tracer au crayon un trait à 2 cm du bas de la papier。Au centre de ce trait tracer un petits “×”. Déposer à l'aide d'un capillaire la solution d’un mélange des acides aminés sur le point “×”. Le dépôt ne doit pas dépasser 2mm de diamètre. Re-déposer la solution au même point en prenant garde de laisser sécher la goutte précédente. Papier pour chromatographie Ne jamais toucher la papier avec les doigts Échantillon: mélange de glycine, leucine

développement Ajouter 5mL de l’éluant dans la grande tube à l’aide un bâton en verre. Ne pas mouiller le paroi intérieur de la tube. Éventuellement placer la papier chromatographique verticalement dans la tube en l’accrochant par l’épingle. Le bas de la papier doit être immergé environ 2mm dans l’éluant. Fixer la tube dans le support en fer à l’aide de pinces. Laisser développer l’éluant lorsque le front d'éluant est arrivé à 2 cm du haut de la papier, Sortir la papier et tracer au crayon le front de l'éluant. bouchon de liège épingle Papier pour chromatographie Ligne de dépôt éluant

révelation Sécher la papier à la température ambiante. Révéler la papier par atomiser la solution de ninhydrine à 0.2%. Chauffer la papier à 100-110℃ au four pour 10 min, il y aura des taches violettes des acides amines. atomiseurs four

calcul Marquer au crayon le centre des taches violettes. Mesurer les distances a, b, c comme montrant dans la figure. Calculer le Rf pour la glycine (tache en bas) et la leucine (tache en haut) glycine leucine Ligne de dépôt Front du solvant

Préparation de la colonne 2. Chromatographie sur colonne Mouiller un morceau de coton avec l’éluant (éthanol à 95%). Enfoncer le coton à l’aide d’un agitateur au fond de la colonne. Préparation de la colonne Un coton Éthanol à 95% Phase Stationnaire (Alumine) Remplissage avec le solvant avoir une répartition la plus homogène possible Papier filtre Alumine Rajoute une papier filtre en tête de colonne au dessus de la surface de l’alumine, S'assurer régulièrement de garder la phase stationnaire humide. coton Une papier filtre

Dépôt d’échantillon Ajouter 5 gouttes de solution d’échantillon (mélange de méthyle d’orange et bleu de méthylène), ouvrir le robinet, laisser couler le solvant jusqu’à ce que l’échantillon entre dans la phase stationnaire. Fermer le robinet.

éluant Ouvrir le robinet, faire éluer en ajoutant l’éthanol à 95% Attention de ne pas assécher la phase stationnaire

Collecter des fractions Collecter le bleu de méthylène lorsque la solution bleu sortie de la colonne Changer l’éluant à l’eau, faire éluer le méthyle d’orange et le collecter.

四、Résultats 1. Chromatographie sur papier valeur de Rf 值：glycine= leucine= 2. Chromatographie sur colonne Decrire l’ordre d’élution des composés et les éluants utilisés

Attenstions: Chromatographie sur papier Chromatographie sur colonne Ne pas mouiller le paroi de la tube lorsque vous ajoutez l’éluant Le dépôt ne doit pas dépasser 2mm de diamètre, s’il faut déposer plusieurs fois, garder de laisser sécher entre chaque dépôt Garder la papier vertical et sans touche la tube, la ligne de dépôt ne doit pas immerger dans l’éluant N’oublier pas de marquer le front de l’éluant Chromatographie sur colonne Garder toujours la surface de l’alumine est inférieurs à la surface de l’éluant Il faut attendre la solution d’échantillon entrer dans l’alumine avant de commencer éluer

Question: Estimer l’ordre de la polarisation de méthyle d’orange et bleu de méthylène

Merci！