MUTAGENESE D’UNE SOUCHE DE LEVURE SOUS L’EFFET DE L’ENVIRONNEMENT TP3: MUTAGENESE D’UNE SOUCHE DE LEVURE SOUS L’EFFET DE L’ENVIRONNEMENT

Des effets mutagènes facilement repérables Situation déclenchante Une souche de Levure (Champignon unicellulaire), appelée Ade2, présente une chaîne de synthèse de l’adénine incomplète aboutissant à l’accumulation d’un composé A.I.R. (Amino Imidazole Ribotide) se pigmentant en rouge par oxydation : la souche est, de ce fait, de couleur rouge (pour cultiver cette souche, il est donc nécessaire d’utiliser un milieu de culture contenant de l’adénine) Toute mutation affectant les gènes impliqués dans cette chaîne de synthèse de l’A.I.R. empêche la formation de ce composé et provoque la disparition du pigment rouge : les levures sont alors blanches. D’autres mutations concernant des gènes importants du métabolisme de la Levure peuvent entraîner la mort de la cellule. Il s’agit de mutations dites létales.

Problématique Problématique : l’intensité d’un agent mutagène, ici les UV, a-t-elle une influence sur le type de gènes qui seront mutés ?

Consigne Formulation de deux hypothèses et de leur conséquences vérifiables Construction d’un tableau de dénombrement des différentes colonies de Levure pour chaque durée d’exposition Réalisation d’un tableau de % de létalité et de % de colonies blanches Construction d’un graphique à l’aide du tableur « Excel » présentant l’évolution des deux pourcentages en fonction de la durée d’exposition aux UV. Réponse aux questions posées permettant de résoudre la problématique..

RESSOURCES RESSOURCES Rappel: Démarche expérimentale Protocole de manipulation en microbiologie RESSOURCES RESSOURCES Aide à la manipulation Aide à la résolution

SIGNIFICATION DES ETAPES   NOM DES ETAPES SIGNIFICATION DES ETAPES OBSERVATION = CONSTAT D’UN PHÉNOMÈNE BIOLOGIQUE OU GÉOLOGIQUE Données d'origines diverses: médias, scolaires, personnelles.. PROBLEME Question issue de l'observation du phénomène biologique ou géologique observé HYPOTHESE Solution provisoire au problème posé. (=supposition) (on peut formuler plusieurs hypothèses pour résoudre un même problème) CONSEQUENCE VERIFIABLE Résultats auxquels on peut s'attendre si l'hypothèse est valide  = Résultats prédictifs

ou SIGNIFICATION DES ETAPES   NOM DES ETAPES SIGNIFICATION DES ETAPES   EXPERIENCE (4 sous-étapes : Principe Dispositif expérimental Protocole Réalisation Elaboration et réalisation d’un protocole expérimental pour éprouver l’hypothèse. Le protocole expérimental doit respecter les 4 règles suivantes : * Le paramètre testé doit être supprimé et/ou doit varier * Il ne faut tester qu’un seul paramètre à la fois ( les autres devant être optimaux et constants ) * Il faut réaliser une expérience témoin * Il faut réaliser plusieurs fois l’expérience RESULTATS Constat des différences entre le début et la fin de l’expérience = Analyse des résultats INTERPRETATION Confrontation des résultats avec les résultats prédictifs d’où l’hypothèse est validée ou réfutée ou Sans formulation d’hypothèse, l’interprétation correspond à l’explication des résultats proposés

Travail en conditions stériles : ATTENTION ! Pour votre sécurité et la réussite de l’expérience, respecter bien les conditions de travail suivantes : Porter une blouse en coton Passer les mains à l’alcool Aseptiser la paillasse Travailler uniquement dans une zone de stérilité lors de la manipulation des levures, des milieux et instruments stériles Ne pas toucher le milieu des boîtes de pétri avec les mains Eviter les mouvements brusques et de parler devant les boîtes ouvertes Placer les pipettes souillées dans un pot de javel Ensemencement: Étalement des suspensions de levures sur la gélose des boîtes de pétri : Toujours agiter la suspension de levures avant d’en prélever, car les levures sédimentent rapidement Verser avec un compte-gouttes stérile, 0,1 ml (2 gouttes) de la suspension de levures ade2 sur chacune des boîtes de milieu de culture mises à votre disposition. Étaler immédiatement avec un étaleur stérile d’un mouvement circulaire et répété, afin de répartir le mieux possible le liquide sur le milieu (attention à ne pas endommager la surface de la gélose). Fermer les boîtes puis tracer sur une des deux boîtes, 4 secteurs sur le fond de la boîte référencés : I, II, III et IV Penser à également indiquer un nom du binôme pour retrouver les boîtes facilement  

Exposition aux UV : Irradiation des boîtes dans l’enceinte aux UV C Éteindre la lampe Introduire la boîte de pétri sectorisée gélose vers le haut dans l’enceinte à UV C. Enlever le couvercle des boîtes (Il est conseillé de laisser les couvercles à l’intérieur pour qu’ils restent dans des conditions de stérilité). Remplacer par un couvercle découpé présent dans l’enceinte en mettant l’ouverture sur le secteur I Vérifier le positionnement de la bavette transparente et la fermeture de la porte battante avant chaque période d’irradiation Démarrer le chronomètre une fois la lampe allumée Exposer pendant 15 secondes le secteur I Tourner le couvercle d’un quart de tour Exposer pendant 45 secondes le secteur II Exposer pendant 90 secondes le secteur III Exposer pendant 120 secondes le secteur IV Dans l’enceinte enlever le couvercle découpé, le remplacer par un couvercle entier puis sortir la boîte de Pétri de l’enceinte.

AIDE à la manipulation Lisez attentivement la fiche technique « Travail en conditions stériles » afin de mener à bien votre expérience. - Suivez rigoureusement les étapes de la fiche protocole : « Ensemencement et exposition aux UV ».

AIDE à la résolution Pour le tableau de dénombrement, pensez aux différentes catégories de colonies qu’il vous faudra dénombrer. Pour le calcul de %, pensez aux quantités totales pour chaque rapport. - Pour répondre à la question sur la variation des effets de l’agent mutagène, comparez les deux courbes du graphique après avoir fait le lien entre les différents types de mutations pouvant affecter la souche Ade2 et les % calculés.