Bienvenue à la présentation de: Christian KONFO Nous souhaitons la bienvenue à tous les participants au colloque

Stabilisation de la boisson locale THEME Stabilisation de la boisson locale «Tchakpalo» par adjonction d’huiles essentielles extraites des feuilles de Cymbopogon citratus, de Crassocephalum rubens et de Lippia multiflora La communication que nous que nous avons l’honneur de vous présenter est intituler

2.2- Objectifs spécifiques III- Cadre de travail, matériel et méthodes PLAN I- Introduction II- Objectifs 2.1- Objectif général 2.2- Objectifs spécifiques III- Cadre de travail, matériel et méthodes IV- Résultats et discussion V- Conclusion Après avoir présenté la problématique qui sous-tends notre sujet , nous aborderons les différents objectifs du travail, le cadre, le matériel et les méthodologies, les différents résultats discutés avant de finir par une conclusion

Sorgho (Sorghum bicolor) (Geofroy,2010) Introduction [1/2] Sorgho (Sorghum bicolor) (Geofroy,2010) En Afrique : importante céréale ancestrale des régions subsahériennes. Aux Etats-Unis : alimentation du bétail et production du bioéthanol En général: produit industriel de l’agroalimentaire aux propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires, Au Bénin: production d’une bière locale dénommée" tchakpalo" La bière locale à base du sorgho, " tchakpalo" : Connue dans toute l’Afrique Encore appelée dolo( Burkina, Mali Sénégal), pito (Ghana), armawa (Rwanda), de bili bili (Tchad) , burukutu (Nigéria) Intérêts nutritionnels mais difficile à conserver (3-5jr). C’est un milieu privilégié de développement de microorganismes, susceptibles d’altérer sa qualité marchande et sanitaire (Odounfa, 1985 ; Kayodé et al., 2005). Le sorgho, Sorghum bicolor est une importante céréale des régions situées au sud du sahara. On l’utilise au Etats unis pour l’alimentation du bétail et la production de bioéthanol. C’est un capital pour l’ AA pour ces antioxydantes. Au bénin, il est avec l’eau la matière première principale utilisé pour la production d’une bière locale mais connue également dans toute l’afrique sous diverses appellation comme le dolo, le pito, le bili bili et autres. C’est une boisson qui présente un intétêt nutritionnel mais qui est très difficile à conserver. En effet, elle est un milieu privilégié de développement des mo susceptibles de mettre en cause ses qualités marchande et sanitaire

La conservation/stabilisation du «tchakpalo» : Introduction [2/2] La conservation/stabilisation du «tchakpalo» : Nécessaire pour conférer une valeur ajoutée au produit.(CAROL, 2001). Nécessité de conservateurs synthétiques (acide citrique: code E330; ascorbique: E300) problématiques pour la santé et l’environnement (Brigand et al;1998). Une alternative : l’utilisation des Huiles essentielles (naturelles) à activités antimicrobiennes, anti-oxydantes (DAWSON, 2005; Burt, 2003; Agrono, 2005; Chami, 2005; OHNO et al., 2003; KOBA et al., 2004; Kouamé et al., 2008; Yèhouénou et al 2010) Il s’avère donc indispensable de stabiliser cette boisson. Mais les conservateurs habituellement utilisés en AA sont d’origine chimique. C’est le cas de l’acide citrique et de l’acide ascorbique qui ne sont pas, sans conséqences sur la santé du consommateur et sur la l’environnement. La revue de littérature nous a permis de remarquer que les HE, réservoir d’antioxydants possedent également des propriétés antimicrobienne avéréés. C’est dans cet ordre d’idée que la présente étude a explorer les possibilités de stabilisation du tchakpalo par adjonction des HE sus-citées. La présente étude sur la conservation/stabilisation du «tchakpalo» par l’adjonction d’HE de C. citratus, L. mutiflora et C. rubens.

Déterminer la composition chimique des huiles essentielles extraites. Objectif général Stabiliser la boisson locale « Tchakpalo » par l’adjonction des huiles essentielles extraites des feuilles de trois plantes aromatiques acclimatées au Bénin. Objectifs spécifiques Déterminer la composition chimique des huiles essentielles extraites. Identifier les microorganismes à l’origine de l’instabilité du tchakpalo Evaluer le pouvoir conservateur des huiles essentielles extraites par rapport à l’acide citrique dans la conservation du tchakpalo. Ce travail vis a Stabiliser la boisson locale « Tchakpalo » par l’adjonction des huiles essentielles extraites des feuilles de trois plantes aromatiques acclimatées au Bénin. Pour y parvenir, nous avons: Déterminer la composition chimique des huiles essentielles extraites. Identifier les microorganismes à l’origine de l’instabilité du tchakpalo Evaluer le pouvoir conservateur des huiles essentielles extraites par rapport à l’acide citrique dans la conservation du tchakpalo.

CADRE DE TRAVAIL, MATERIEL ET METHODE En ce qui concerne le CADRE DE TRAVAIL, MATERIEL ET METHODE

CADRE DE TRAVAIL La production du tchakpalo a été réalisée en milieu réel. Le conditionnement, l’encapsulation, la pasteurisation ainsi que les travaux de laboratoire ont été effectués au Laboratoire d’Etude et de Recherche en Chimie Appliquée (LERCA/EPAC/UAC)

Matériel végétal : Matériel [1/3] NC: Sorgho rouge Fon: Abokoun Yoruba: BABA Adja: Opo Fon : Aglala, Aklala Yoruba : Efintin, Mina : Avundati Syn: Senecio rubens Yoruba: Bréde NC: citronnelle Fon : ca man Yoruba: Koriko Minan : Tigbé Le matériel végétal utilisé au cours de ce travail est constitué de Feuilles de Lippia multiflora récoltées Kpakpassa , sol argilo-limoneux gravionnaire . Feuilles de Crassocephalum Rubens récoltées à Tchakaloké sur un sol ferrugineux gravionnaire. Sorgho de variété rouge Sorghum bicolor (L) Moench). ; acheter à Glazoué Feuilles de Cymbopogon citratus récoltées dans le plateau de l’Ouémé sur un sol ferralitique sableux.

Souches de référence (LNSP) Matériel [2/3] Matériel biologique : Les souches fongiques isolées du tchakpalo tels que………… ont été utilisées Des souches de référence A. niger, P. camamberti F . oxysporum, S.cerevisiae, E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 Souches isolées du tchakpalo Souches de référence (LNSP)

Matériel [3/3] Matériel de production du tchakpalo: (Balance,thermomètre, des marmites, des bidons et bouteilles… Matériel de laboratoire  Matériel lourd (étuve, extracteur de type clevenger, autoclave, microscope etc.), matériel léger (milieux de culture, coton cardé, boite de pétrie, tween 80 etc.)

METHODES

Méthodes [1/13] Méthode d’extraction et d’analyse des huiles essentielles Appareil de type Clevenger Extraction des HE par Hydrodistillation et calcul du rendement d’extraction CPG +CPG/SM *100 Rdt =

Méthodes [2/13] Analyse microbiologique des échantillons de tchakpalo en vue d’identifier surtout les microorganismes à l’origine de son instabilité Isolement et identification des levures et moisissures contaminant le Tchakpalo Identification par microscopie avec les clés de Samson et al. (2004) et Pitt et al. (2009). Tests antifongiques (Kanko, 2010) Etude de l’activité antibactérienne et antilévurique HE (Yèhouenou et al. 2010) CMI et CMB

Méthodes [6/13] Technologie de production du tchapkalo Figure 1: Technologies de production du tchakpalo Maltage du sogho Technologie traditionnelle Saccharification Technologie améliorée Fermentation (12 H) Huiles essentielles / acide citrique (0,1/1000mL) Conditionnement Pasteurisation (95°C/10 min)

METHODES [10/13] Analyses microbiologiques Analyses Physico- chimiques Matière sèche (A.O.A.C. ,1984) pH et l’acidité titrable (A.O.A.C., 1997) Teneur en alcool (Konfo, 2008) Sucres totaux (Dubois et al (1965) Degré Brix (Adjou et al., 2011) Analyses microbiologiques La flore totale (NF EN ISO 6222 1999) Les levures et moisissures (NF EN ISO 7954 1999) Coliformes totaux, thermotolérants et E. coli (NF EN ISO 4831 1999) Staphylococcus aureus (NF EN ISO 6888 -1, 1999)

Résultats et discussion

Résultats et discussions[1/18] Analyses microbiologiques des échantillons de tchakpalo achetés G.A.M (UFC/ml) Levures Moisissures C t (UFC/ml) C th (UFC/m) E.coli (UFC/m) Glazoué J 1 56.102 2,2.102 80 Absents J5 5,107 6.106 1,2.102 J10 8.1012 9.1011 1,9.104 Dassa 84.102 4,1.102 < 1 8.107 7.107 02 2,22.1013 1,201012 06 Cotonou 17,2.102 3 ,2.102 2.5.107 5.106 01 5,8.1012 3,2.1011 04 Norme (FAO/OMS) ≤106 ≤104 ≤ 104 ≤ 10 Prédominance des levures et moisissures Ces résultats sont en accord avec Ategbo (1985) (Bénin) Maoura et al. 2005(Tchad) Aka et al (2008) (CI) - activité α-amylasique (Djould, 2004) - inoculation du ferment (Yao et al., 1995 ; Mouara et al. , 2006), - Le mode de commercialisation

Résultats et Discussions [2/18] Moisissures identifiées Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium camembertii. Levures identifiées Saccharomyces cereviciae

Résultats et Discussions [3/18] Rendement des extractions d’huiles essentielles. Huiles Essentielles Cymbopogon citratus Lippia multiflora Crassocephalum rubens Rendements 1,70% 1,07% 0,13% Yèhouénou et al. en 2010 0,16%. Ayédoun et al. en 1997 = 1,4% Bassila. kouamé et al. 2008 1,2% En accord avec Lieu de récolte temps de récolte ° de séchage… Alitonou 2006 (1,4%), Gouollaly et al en 2010 =1,6% Kanko , (2010) 0,7%. En désaccord avec

Résultats et Discussions [4/18] Composés majoritaires des huiles essentielles testées Cymbopogon citratus. Lippia multiflora Composées antibactériens % 1,8-cinéole 50,6 Sabinène 13,8 δ –terpinol Nom des composés % géranial 41,3 Néral 33,0 Myrcène 10,4 Géraniol 6,6 Crassocephalum rubens Yèhouénou et al., (2010) Alitonou, (2006) Kanko et al (1999) Koumaglo et al., (1996) Dugo et al., (1998) Pino et Rosado, (2000) Grubber et Denton (2004) Lemmens, (2003) Composées % Limonène 48,8 Myrcène 30,7 E-β- ocimène 7,4 α- thuyène 4,6

Résultats et Discussions [5/18] Activité antifongique Cymbopogon citratus sur Fusarium oxysporum Cybopogon citratus Sur Aspergillus niger Cymbopogon citratus sur Penicilium camembertii

Résultats et Discussions [6/18] Lippia multiflora Fusarium oxysporum Lippia multiflora sur Aspergillus niger Lippia multiflora Penicillium camembertii

Résultats et Discussions [7/18] . Crassocephalum rubens sur Fusarium oxysporum Crassocephalum rubens sur Aspergillus niger Crassocephalum rubens Penicillium camembertii

Résultats et Discussions [8/18] CMF= Concentration Minimale Fongicide Les HE de Cymbopogon citratus et de Lippia multiflora sont plus actives sur les souches fongiques testées avec des taux de réduction allant jusqu'à 92,9 pour Cymbopogon citratus et 92,8 pour Lippia multiflora. Quelques soit la dose d’HE de Crassocephalum rubens, aucune réduction mycélienne de plus de 61,6% Après réintroduction des disques mycéliens des boîtes de Pétri dans un milieu neuf sans HE, aucune reprise de croissance mycélienne n’a été observée. C. citratus L. multiflora Cr. rubens S. cerevisae CMI (mg/ml) 0,24 0,25 1,66 CMF(mg/ml) 0,49 0,5 3,33

Résultats et Discussion [9/18] Activité antibactérienne. C. citratus L. multiflora Cr. rubens Escherichia coli ATCC 25922 CMI (mg/ml) 0,99 1,01 mg/ml 3,33 CMB (mg/ml 1,99 2,02 mg/ml - CMB/CMI 2,01 2 Interprétations Bactéricide Bactériostatique Staphylococcus aureus ATCC25923 0,49 0,25 l 6,67 CMB (mg/m)l 0,50 2,02 1 -Bactéricide si CMB/CMI<4 -bactériostatique Si CMB/CMI ≥ 4 (Kouamé et al, 2008) Onawumi et al., (1984 ); Chaumont et al., (2001); Yehouenou et al. (2010) Koba et al., 2003); kanko et al (2004); kouamé et al., (2008); Gouollaly etal.(2010

Résultats et Discussion [10/18] L’activité biologique d’une substance est due à la présence dans celle-ci de certaines molécules. Ces molécules agiraient le plus souvent par une action synergique, soit seule. (Deans et al., 1987 et Bajpai et al.,2008 ;). Selon kouamé et al . 2008, l’essence de Lippia multiflora doit 1,8-Cinéol (48,9%), le Géranial (15,1%) et l’α-Terpinène (8,5%) Cymbopogon citratus: est due, à une forte concentration en aldéhydes monoterpéniques (néral,géranial). (Onawumi et al., 1984 ; Leichtnam, 1996 ; Schaneberg et al., 2002) Yehouénou et al. assimilent l’activité antimicrobienne de l’HE de Crassocephalum rubens à son pourcentage élevé de limonène (48,8%).

Résultats et Discussion [11/18] Préparation du tchakpalo R= 2,85 L/Kg. Saccharification Séchage Germination E1 :Tchakpalo+ Acide citrique 0,1/1000 E0 échantillons témoins E2 : Tchakpalo+Cymbopogon citratus 0,1/1000 E3 Tchakpalo+Lippia multiflora 0,1/1000

Résultats et Discussion [12/18] Analyses physico-chimiques Taux d’humidité, de matière sèche et Densité. Echantillon Analyses effectuées E0 E1 E2 E3 Taux d’humidité (%) 88 86 87 89 Taux de matière sèche (%) 12 14 13 11 Densité 1,032 1,034 1,031

Résultats et Discussion [13/18] Degré Brix et acidité titrable Dosage du taux d’alcool Echantillons MSST (°Brix) Acidité titrable (g/l) Eo 15,2 6,37 E1 14,8 6,43 E2 14,6 5,07 E3 5, 69 Echantillons Taux d’alcool (% vol) Eo < 6 E1 E2 E3

Résultats et Discussion [14/18] Eo: témoins négatif E1 :Tchakpalo+Acide citrique E2 : Tchakpalo+Cymbopogon citratus E3 Tchakpalo+Lippia multiflora Figure 21 : taux de sucres totaux des échantillons

Résultats et Discussion [15/18] Ces résultats sont en accord avec Aka et al. 2008 sur le chakpalo en Côte d’Ivoire Lyumugabe et al. 2010 Résultats similaires sur le Ikigage pour le pH (3,9), °Brix (11,6) Mais des valeurs plus faible d’acidité titrable (1,72g/l) et du taux d’alcool (2,2° vol). Sawadogo et al. en 2007 (0,13° vol à 0,61° vol) dolo et le pito.

Résultats et Discussion [16/18] Le taux de sucres totaux faible dans l’échantillon E0 s’expliquerait par la présence de levures dans cet échantillon. Taux d’alcool <6% vol: teneur faible en sucres fermentescible. Selon Novellie (1982), cela peut être la conséquence d’une faible teneur en β-amylase. ANALYSES MICROBIOLOGIQUES Pendant la conservation: Absence de moisissures, de Ct, Cth , E.coli et S. aureus; Présence de levures dans l’échantillon E0, Présence de GAM dans tous les échantillons.

Résultats et Discussion [17/18] Figure 22 : Evolution des GAM en fonction du temps Figure 23: Evolution des levures en fonction du temps Eo: témoins négatif E1 :Tchakpalo+Acide citrique E2 : Tchakpalo+Cymbopogon citratus E3 Tchakpalo+Lippia multiflora

Résultats et Discussion [18/18] Agréable+ très agréable (100%)Désagréable+indifférent (16% )pour Lippia multiflora (arôme de médicament) Agréable+ très agréable (100%) Figure 28 : Appréciation organoleptique (arôme) des échantillons de tchakpalo Figure 27 : Appréciation organoleptique (goût) des échantillons de tchakpalo Eo = Echantillon témoin; E1= Echantillon ayant reçu de l’acide citrique ; E2= Echantillon ayant reçu l’huile essentielle de Cymbopogon citratus E2= Echantillon ayant reçu l’huile essentielle de Lippia multiflora TD = Très désagréable D= désagréable I= Indifférent A= Agréable TA= Très agréable

CONCLUSION

Conclusion Ce travail a permis: D’identifier la microflore d’altération et de fermentation du tchakpalo; De réaliser les tests antimicrobiens sur cette dernières; De produire le tchakpalo et d’étudier le pouvoir conservateur de nos HE par rapport à l’acide citrique.

MERCI DE VOTRE AIMABLE ATTENTION