Structure SAXS de la micelle de caséine sous compression osmotique 1 Structure SAXS de la micelle de caséine sous compression osmotique A. Bouchoux*, G. Gésan-Guiziou*, J. Pérez#, B. Cabane§ [Dalgleish, IDJ, 2004] *STLO, INRA - Agrocampus Ouest UMR 1253, F-35000 Rennes, France #Synchrotron SOLEIL, SWING, F-91192 Gif Sur Yvette, France §PMMH, CNRS UMR 7636, ESPCI, F-75231 Paris, France

Une éponge à 3 niveaux de structure ? 1bis La micelle de caséine : Une éponge à 3 niveaux de structure ? A. Bouchoux*, G. Gésan-Guiziou*, J. Pérez#, B. Cabane§ [Dalgleish, IDJ, 2004] *STLO, INRA - Agrocampus Ouest UMR 1253, F-35000 Rennes, France #Synchrotron SOLEIL, SWING, F-91192 Gif Sur Yvette, France §PMMH, CNRS UMR 7636, ESPCI, F-75231 Paris, France

La micelle de caséine. Ce que l'on sait 2 . Composition as1-, as2-, b-, k- caseins 8% minéraux (Ca2+, phosphate) ~ 1000 nanoclusters CaP (5 nm) . "Gros" agrégats globulaires Diamètre ~ 100 nm (30-40% polydisperse) . Objet mou et poreux ("microgel") Hydratation ~ 3.7 gH20/gcas . Surface Brosse de k- caseins . Colloïde "dynamique" Sensible pH, T, présence de sels,... Etat natif (lait) → pH 6.7 / I  100 mM Caséines = 80% (25 g/L) protéines du lait [Dalgleish et al., IDJ., 2004]

Structure interne. Controverse (50 ans de...) 3 1- Sous-micelles 2- "Homogene" [Walstra, IDJ., 2004] [Holt, Coll.Surf.A., 2003] 3- Cœur-Couronne 4- Micelles + mini-micelles connaitre structure interne = connaissance fondamentale, comment est structuré objet et in fine, par quelle force, permettra d'avancer sur de nbs points ayant attrait à la manipulation (procédés), l'utilisation de cet objet (drug delivery), etc... [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007] [Shukla, Soft Matter, 2009]

Comment aller plus loin ? 4 [McMahon, JDS, 2009] - Quelle technique d'observation ? . Microscopie . Tomographie . Diffusion de rayonnement aux petits angles (SAXS, SANS) - Quelle "stratégie" ? . Concentration et environnement "natifs" . Chgts pH, T, +NaCl... . Environnement "natif", concentrations élevées - Nos questions: . Quels changements de structure lors de la compression ? . Quid modèles actuels ? . Si non, peut-on construire un modèle qui décrit ces chgts & reste cohérent des pts de vue physique et biologique ? [Pignon, JCP, 2004] C déformation - compression Microscopie TEM - SEM, surface ou projection 2D d'un volume Tomographie -> résolution encore trop faible Diffusion de rayonnement techniques de choix - gamme de taille tombe très bien Concentration et environnement natif -> a été fait mais profil permet pas de trancher encore de façon cklaire entre différents modèles Modif envionnement, intéressant mais difficultés d'interprétation si on ne sait pas d'où l'on part Solution - rester natif et regarder la structure de la micelle a haute concentration Compression -> on sait faire (étude filtration et autre procédés de concentration). On sait qu'on déforme la micelle, on la compresse. Vient perdre son eau.

Taille - Forme - Structure interne - Organisation SAXS. Principe 5 "Small angle x-ray scattering" "Diffusion de rayons x aux petits angles" - Rayons X : l  0.01-10 nm (100-100000 eV) typiquement l  0.1 nm (1 Å) - Diffusion de rayonnement : Faisceau RX incident perturbé par e- de l'échantillon et dévié dans de multiples directions Diffusion tous points échantillon à 1 angle = 1 point détecteur Rayons X Échantillon Détecteur Interférences entre rayons diffusés à un même angle q1 q2 I(q) q Distribution angulaire des intensités = répartition spatiale des diffuseurs dans le matériau Taille - Forme - Structure interne - Organisation

SAXS. Principe q - Objet sphérique plein : ~1/R I(q) 2R q 6 - Objet sphérique plein : ~1/R I(q) 2R q Déphasage q . Très petits angles, q < 1/R = en phase, faible déphasage Somme des rayons diffusés est maximale . Angles + grands, q > 1/R = déphasage important → interférences déstructives Somme des rayons diffusés s'amenuise Vecteur de diffusion (= inverse distance)

I(q) = répartition spatiale des hétérogénéités dans l'échantillon SAXS. I(q) = fct (taille, forme, structure interne) 7 I(q) = répartition spatiale des hétérogénéités dans l'échantillon Particules homogènes : I(q) = fct(taille, forme) Particules structurées : I(q) = fct(taille, forme, hétérogénéités internes) I(q) ~1/R1 ~1/R2 q I(q) ~1/R1 ~1/R2 q Equation générale : p(r) = "Pair distance distribution function" = r2 * nb de segments différents de longueur r reliant 2 e- de la structure (de l'échantillon) = Fct (taille, forme, densités électroniques internes)

SAXS. Sphères mono- et polydisperses, Coeur-Couronne 8 I(q) = fct (taille, forme, structure interne) (en solutions diluées...)

SAXS. Effet "organisation" aux C élevées 9 I(q) = fct (taille, forme, structure interne, organisation) Peu concentré . Interférences destructrices aux courtes distances seulement, i.e., pour qR > 1 Concentré Répulsions, particules s'ordonnent . Interférences destructrices dès les grandes distances = transparence . Interférences constructives dans certaines directions = pics de Bragg concentré = système homogène aux grandes échelles = transparence [Cabane, 2007] S(q) = facteur de structure

Manipulations 10 . Micelles de caséine = PPCN + perméat d'ultrafiltration d'un lait . Compression par stress osmotique P C = Dialyse contre polymère à P donnée [Bouchoux, Biophys.J., 2009] [Bouchoux, JCP, 2009] feff = 0.1 feff = 0.7 feff = 1.8 25 g/L 167 g/L 400 g/L Liquide Gel / Solide . SAXS (SWING, Soleil, Gif/Yvette), cellules mica, 3 "shifts" (24 h)

Concentration native. 25 g/L, feff = 0.1 11     Forme globale des micelles Sphères polydisperses dmoyen ~ 100 nm  "Oscillation intermédiaire" q  1-2.10-2 Å-1, i.e., distances  10-40 nm . Coeur-couronne . Minimicelles [Shukla, Soft Matter, 2009] [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007]  Nanoclusters CaP dmoyen ~ 4-5 nm

Concentration native. 25 g/L, feff = 0.1 11    Compression ?

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

12 Compression. I(q)

Compression. I(q) 12 feff = 0.1 feff = 0.7 feff = 1.8

Compression. I(q) Micelle non comprimée feff = 0.1 feff = 0.7 12 Micelle non comprimée feff = 0.1 feff = 0.7 feff = 1.8 Micelle déformée & comprimée

13 Compression. q2I(q)

13 Compression. q2I(q)

13 Compression. q2I(q)

13 Compression. q2I(q)

Compression. q2I(q) 13 feff = 0.1 Micelle non comprimée feff = 0.65

Sphères polydisperses concentrées + volume libre Compression. q2I(q) 13 feff = 0.1 Micelle non comprimée feff = 0.65 100 g/L 150 g/L Sphères polydisperses concentrées + volume libre (en accord avec P, h) Seff(q) = I(q)/I(q)C=25g/L

14 Compression. q2I(q)

14 Compression. q2I(q)

14 Compression. q2I(q)

14 Compression. q2I(q)

14 Compression. q2I(q)

Compression. q2I(q) feff = 0.7 feff = 1.8 Micelle déformée & comprimée 14 feff = 0.7 feff = 1.8 Micelle déformée & comprimée

Compression. Déformation non-affine 15 Micelle déformée & comprimée . "Aplatissement" des spectres q-3 → q-2 . "Creusement" du Seff(q) feff = 0.7 Seff(q) = I(q)/I(q)C=25g/L feff = 1.8

distances carac. < taille micelle Compression. Déformation non-affine 15 Micelle déformée & comprimée . Distances caractéristiques D1 et D2 constantes D1 feff = 0.7 D2 A la compression, distances carac. < taille micelle restent inchangées feff = 1.8

Compression VS modèles actuels 16 1- Sous-micelles ? [Walstra, IDJ., 2004] . Fortes corrélations entre sous-micelles . Déformation & compression des sous-unités

Compression VS modèles actuels 16 1- Sous-micelles ? [Walstra, IDJ., 2004] . Fortes corrélations entre sous-micelles . Déformation & compression des sous-unités Non

Compression VS modèles actuels 17 2- Homogène ? [Holt, Coll.Surf.A., 2003] . Pas d'oscillation intermédiaire . Compression affine, type "microgel"

Compression VS modèles actuels 17 2- Homogène ? [Holt, Coll.Surf.A., 2003] . Pas d'oscillation intermédiaire . Compression affine, type "microgel" Non

Compression VS modèles actuels 18 3- Cœur-couronne ? [Shukla, Soft Matter, 2009] . Oscillation intermédiaire fluctuante pour tous types de déformation

Compression VS modèles actuels 18 3- Cœur-couronne ? [Shukla, Soft Matter, 2009] . Oscillation intermédiaire fluctuante pour tous types de déformation Non

Compression VS modèles actuels 19 4- Mini-micelles ? [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007] . Oscillation intermédiaire fluctuante . Concentration en mini-micelles pas réaliste

Compression VS modèles actuels 19 4- Mini-micelles ? [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007] . Oscillation intermédiaire fluctuante . Concentration en mini-micelles pas réaliste Non

Nouveau modèle. Éponge 20 = Coexistence de régions "dures" et de régions "molles" au sein de la micelle résistent à la compression s'effondrent à la compression Modèles à cellules "Régions dures" CaP A la compression, distances carac. < taille micelle restent inchangées on propose donc un modèle qui décrit le systéme comme formé de... Limite 1 -> dilué :

Nouveau modèle. Éponge 20 = Coexistence de régions "dures" et de régions "molles" au sein de la micelle résistent à la compression s'effondrent à la compression Modèles à cellules "Régions dures" CaP Limite 2 -> concentré :

Nouveau modèle. Éponge 20 = Coexistence de régions "dures" et de régions "molles" au sein de la micelle résistent à la compression s'effondrent à la compression Modèles à cellules "Régions dures" CaP Interpolation :

Nouveau modèle. Éponge / 3 niveaux de structure 21 2 Niveaux de structure interne Niveau 1 = Régions "dures" Niveau 2 = Nanoclusters CaP Structure globale Niveau 0 = Micelle + Micelle Régions "dures" Nanoclusters CaP

Fits Fits a, b et c = f(C) Hypothèse : Pn(q) = Facteur de forme 22 Hypothèse : Pn(q) = Facteur de forme de sphères polydisperses Fits a, b et c = f(C)

Fractions volumiques -> f0, f1, f2 23 f0 = volume occupé par les micelles ds la dispersion f1 = volume occupé par les région "dures" ds la micelle f2 = volume occupé par les nanoclusters ds les régions "dures" A

Fractions volumiques -> f0, f1, f2 24 f0 = volume occupé par les micelles ds la dispersion f1 = volume occupé par les région "dures" ds la micelle f2 = volume occupé par les nanoclusters ds les régions "dures" A B f0*f1*f2 = volume de nanoclusters ds la dispersion = cst * C(g/L)

La micelle de caséine -> une "éponge hiérarchique" 25 . Modèle cohérent du pt de vue physique . Pt de vue biologique ?

La micelle de caséine -> une "éponge hiérarchique" 26 . Micelle issue d'un processus hiérarchique... avec un modele "cellulaire" + "hierarchique" on retrouve une organisation presque autosimilaire, comme le dit le SAXS, tout en restant proches de la realite biologique.... [Clermont, Ana.Rec., 1993]

A suivre... . Spectres SAXS  conditions physico-chimiques, VS C 27 . Spectres SAXS  conditions physico-chimiques, VS C 3 M Urée 15% éthanol pH 10 0.3 M NaCl . Amélioration du modèle . Nouvelles expériences : SANS (ILL Grenoble, 2011) Variation de contraste D2O / H2O [Shukla, Soft Matter, 2009]

Structure - Organisation SAXS. Principe "Small angle x-ray scattering" "Diffusion de rayons x aux petits angles" - Rayonnement synchrotron : Haute brillance, manips rapides, haute résolution Acquisition I(q) q Spectre 1D q Synchrotron = haute brillance = nombre de photons émis par seconde, à une certaine longueur d’onde et dans une bande spectrale déterminée, par unité de surface de source et par unité d’angle solide Synchrotron = manips rapides (moins d'1s), haute résolution Spectre brut, 2D Taille - Forme Structure - Organisation q  0.01-1°

SAXS. Phase et interférences - Objet sphérique plein : Déphasage I(q) faible élevé q Déphasage q [Kratky & Glatter, SAXS, 1982] . Très petits angles = en phase, faible déphasage Somme des rayons diffusés est maximale . Angles + grands = déphasage important → interférences déstructives Somme des rayons diffusés s'amenuise

SAXS. I(q) = fct (taille) - Objet sphérique plein : I(q) ~1/R1 2R1 q1 ~1/R2 Déphasage q Particule + grosse : même déphasage à un angle plus petit Shift du spectre vers plus petits q 2R2 q2 < q1 Déphasage

SAXS. Particules homogènes nb part./vol volume part. Equation générale contraste facteur de forme Sphères monodisperses R = 50 nm

SAXS. Particules homogènes nb part./vol volume part. Equation générale contraste facteur de forme polydisperse Sphères polydisperses monodisperse Sommation des I(q) pour chaque taille → "lissage" du signal Rmoyen = 30 nm Distribution log-normale Polydispersité 40%

SAXS. Particules structurées Equation générale Cœur-Couronne . Couronne 10x plus dense . Épaisseur = 15% Rcœur . Objets polydisperses Cœur-Couronne Rmoyen = 30 nm Distribution log-normale Polydispersité 40% Densité e- homogène

SAXS. Effet "forme" I(q) = fct (taille, forme, structure interne)

SAXS. Effet "organisation" aux C élevées I(q) = fct (taille, forme, structure interne, organisation) Peu concentré . Interférences destructrices aux courtes distances seulement, i.e., pour qR > 1 Concentré Répulsions, particules s'ordonnent . Interférences destructrices dès les grandes distances = transparence . Interférences constructives dans certaines directions = pics de Bragg concentré = système homogène aux grandes échelles = transparence [Cabane, 2007] S(q) = facteur de structure

Concentration native. 25 g/L, feff = 0.1 12  Forme globale des micelles Sphères polydisperses dmoyen ~ 100 nm   "Oscillation intermédiaire" q  1-2.10-2 Å-1, i.e., distances  10-40 nm . Coeur-couronne . Minimicelles  [Shukla, Soft Matter, 2009] [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007]   Nanoclusters CaP dmoyen ~ 4-5 nm [Marchin, JCP, 2007]

Concentration native. 25 g/L, feff = 0.1   "Oscillation intermédiaire" q  1-2.10-2 Å-1, i.e., distances  10-40 nm . Coeur-couronne . Minimicelles  [Shukla, Soft Matter, 2009] [Müller-Buschbaum, Biophys.J., 2007]

Schurtenberger & Stradner Fribourg, CH Lund, SE [Moitzi, Langmuir, 2010] "Inverse" core-shell model ?

Previous studies  interactions Rheology       [Bouchoux et al., Biophys.J., 2009], [Bouchoux et al., J.Chem.Phys., 2009]  interactions Rheology       Liquid Gel  Liquid -> Polydisperses "hard" spheres  Transition -> ~ Close-packing, C = 150-200 g/L, feff =0.7-0.9  Gel -> Micelles get deformed and shrink ~ microemulsion-, microgel analogy

SAXS. Particules homogènes nb part./vol volume part. Equation générale contraste facteur de forme Anneaux torsadés etc... tout un atlas, voir : http://kur.web.psi.ch/sans1/SANSSoft/sasfit.html

AFM. Micelles séchées sur mica

AFM. Micelles séchées sur mica