Protéger et restaurer les ressources locales en châtaignier par le contrôle biologique des pathogènes du châtaignier (a) Jonathan Bourquin1, Bastien Cochard1, Romain Chablais1, Julien Crovadore1, Francesco Bonavia2 & François Lefort1. 1Groupe Plantes et pathogènes, Institut Terre Nature et Environnement, hepia, HES-SO//Genève 150 route de Presinge, 1254 Jussy, Suisse. E-mail: francois.lefort@hesge.ch 2Vivaio forestale cantonale, Dipartimento del territorio, Divisione dell’ambiente, Sezione forestale Repubblica e Cantone Ticino, 6835 Morbio Superiore, Suisse Plusieurs pathogènes causent d’important dégâts aux cultures de châtaigniers (Castanea sativa) en Europe et en Suisse. (A) (B) (C) (D) Fig. 3 : (A) Prélèvement des scions en pépinière et en forêt. Puis, élimination des feuilles avant trempage, (B) inoculation des antagonistes pendant 18h à T°C ambiante, (C) 5 à 8 bourgeons sont prélevés pour le greffage, (D) greffe en « chip budding » Gnomoniopsis smithogilvyi, un champignon endophyte, a été récemment identifié comme étant un agent causal du chancre du châtaignier (d’abord uniquement attribué à Cryphonectria parasitica) et comme l’organisme responsable de la pourriture brune de la châtaigne. Fig. 1 : (A) greffon mort avec chancre développé à partir du point de greffage, (B) arbre greffé malade avec fructifications grisâtres de Gnomoniopsis smithogilvyi visibles sur l’écorce. (A) (B) Arbres mères : les scions sont prélevés sur des arbres en pépinière ou en forêt. Modalités : 3 modalités de traitement sont testées : T. hamatum, P. putida, T. hamatum & P. putida. Un contrôle négatif (eau) est également mis en place. Paramètres mesurés : taille du chancre (cm2), symptômes visuels (suivant des catégories préalablement définies), présence/absence de fructifications de G. smithogilvyi et C. parasitica. Cet endophyte peut devenir pathogène dans des conditions encore non décrites, mais sûrement en lien avec une perturbation de l’équilibre de la communauté microbienne endophyte, sous l’action de différents facteurs biotiques et abiotiques. Au Tessin, cet organisme est très largement répandu et semble être le principal responsable de la forte mortalité des châtaigniers dans les jeunes vergers fruitiers. Expérience 3 - Métagénomique But : Etudier les changements dans la communauté d’endophytes dans des scions infectés par G. smithogilvyi et traités par les antagonistes. Deux agents de contrôle biologique prometteurs, Pseudomonas putida et Trichoderma hamatum, ont récemment été identifiés. Afin de tester et développer une solution concrète de lutte contre G. smithogilvyi à l’aide de ces deux antagonistes, il a été décidé de mener plusieurs expériences. Deux expériences in vivo en collaboration avec la pépinière forestière cantonale du Tessin et une expérience in vitro combinée à de la métagénomique. Traitements: deux modalités de traitement sont appliquées. Soit le pathogène est inoculé en premier, soit les antagonistes. Ceci afin d’évaluer la différence d’efficacité des antagonistes en traitement préventif ou curatif. Des contrôles où les scions ne sont pas traités par les antagonistes ou non traités sont établis. 48h G. smithogilvyi T. hamatum, P. putida, mix, eau 6 semaines Fig. 4 : (A) Des grands scions (1m, ⍉ 1cm) sont récoltés dans le canton de Genève, puis coupés en 5 scions de 20cm, (B) suivant la modalité les scions sont trempés 48h dans une solution d’antagonistes ou de pathogène, ou d’eau stérile pour le contrôle négatif, (C) Les scions sont scellés dans des tubes en verre puis mis 6 semaines en chambre climatique afin de laisser le temps aux microorganismes de s’installer, (D) suivant la modalité les étapes (B) et (C) sont répétées avec le pathogène ou les antagonistes. (A) (B) (C) (D) Matériels et méthodes Expérience 1 - Biostimulant But : évaluer l’effet biostimulant et protecteur des deux antagonistes sur des châtaigniers infectés par G. smithogilvyi et C. parasitica . Test moléculaire : Test de la présence de G. smithogilvyi et C. parasitica dans les arbres. 2 X G. smithogilvyi ? C. parasitica ? (A) (B) (C) (D) Fig. 2 : (A) échantillonnage, (B) extraction ADN total et PCR avec primers spécifiques pour les deux pathogènes (GSF/GSR et CPF/CPR), (C) électrophorèse sur gel 0.1% agarose, (D) identification Métagénomique : Afin d’étudier la communauté microbienne endophyte après traitement, les scions sont ensuite découpés en lamelles. L’ADN total en est extrait et séquencé dans un séquenceur Illumina MiniSeq, et les résultats analysés afin de calculer l’abondance relative des endophytes présents dans les scions. Abondance relative des endophytes (A) (B) (C) Fig. 4 : (A) scions découpés en 4 parties prélevées de manière uniforme sur toute la longueur du scion, (B) extraction de l’ADN total, (C) analyse bioinformatique et calcul des abondances relatives des différents endophytes Traitements et modalités : Trois modalités de traitement sont testées : T. hamatum, P. putida, T. hamatum & P. putida. Un contrôle négatif (eau) est également mis en place. L’inoculation des antagonistes se fait par arrosage. Le traitement est effectué trois fois. Deux fois en été et une fois en automne. Matériel: 200 châtaigniers de 2 ans en pépinière. Paramètres mesurés : circonférence du tronc (mm) à hauteur du pot et longueur de la tige principale (cm). Conclusion Expérience 2 - Greffage But : L’infection par G. smithogilvyi semble se développer à partir du greffage. L’objectif est donc de tester une méthode pour prévenir l’infection à ce moment là. Les deux expériences sur les châtaigniers en pépinière devraient permettre de tester à large échelle ces deux antagonistes in vivo afin de développer au plus vite un traitement efficace contre ce nouveau pathogène. L’analyse métagénomique des scions infectés et traités devrait quant à elle donner des informations pertinentes sur l’impact des deux antagonistes sur la communauté des endophytes présent dans les châtaigniers et sur leur capacité à s’installer comme endophyte. Traitement : L’inoculation des antagonistes se fait par trempage du scion sur lequel sont prélevés les bourgeons à greffer. Matériel: 635 châtaigniers de 1 an en pépinière. JOURNEES D'AUTOMNE SGP / SSP 2017 Diagnostique en phytiatrie: clé du succès en protection des plantes? 8-9 septembre 2017, hepia, Genève