Génétique – Cours 14 LE TRAITEMENT DES MALADIES GÉNÉTIQUES

LE TRAITEMENT DES MALADIES GÉNÉTIQUES. Parmi les environ 12 LE TRAITEMENT DES MALADIES GÉNÉTIQUES Parmi les environ 12.000 maladies génétiques de l’être humain qu’on connaît jusqu’à présent, il y en a très peu qui bénéficient d’un traitement efficient. A présent, la médecine lutte contre les conséquences des anomalies génétiques, essayant d’assurer un contrôle adéquat de la maladie, pour améliorer son évolution. Dans ce sens, les tentatives d’amélioration des maladies génétiques font appel à l’intervention chirurgicale de correction, à la diète restrictive et au traitement médicamenteux

1. Le traitement chirurgical de correction est indiqué dans: -la correction des malformations congénitales telles : - l’atrésie anale, oesophagienne, -des anomalies des organes génitaux externes, - la polydactylie, la syndactylie, -le cheiloschisis, le palatoschisis, -des malformations cardiaques et rénales, etc. -prophylactiquement: - la colectomie dans la polypose adénomateuse du côlon, dans les syndromes de susceptibilité familiale au cancer colorectal;

-thérapeutiquement pour l’amélioration de l’évolution d’une maladie: - la splénectomie dans la maladie de Gaucher, l’ anémie falciforme; -la thyroïdectomie, dans le carcinome thyroïdien; -la ténotomie pour empêcher les rétractions tendineuses dans les dystrophies musculaires progressives; - l’extirpation des formations malignes, etc.;

-transplantation d’organes comme: 1) les reins, dans la tumeur de Wilm’s, le rein polykystique; 2) la moelle osseuse dans: l’immunodéficience sévère combinée, la leucémie, les hémoglobinopathies, l’agammaglobulinémie, la maladie de Hurler; 3) la cornée, dans les dystrophies cornéennes; 4) le thymus, dans le syndrôme Di George; 5)les poumons, dans la fibrose kystique

2. Dans le cas des erreurs innées de métabolisme, le traitement peut être réalisé à l’aide de  la diète restrictive dans: -la galactosémie (on élimine de l’alimentation la galactose et la lactose); -la phénylcétonurie (on réduit la phénylalanine); -l’hypercholestérolémie familiale (on élimine de l’alimentation les matières grasses d’origine animale); -l’homocystinurie (la diète est riche en cystéine et pauvre en méthionine); -l’hémochromatose (on évite les transfusions);

La diète de substitution du déficit de produit final: -le rachitisme vitamino-D-résistant (vitamine D, sels phosphocalciques et vitamine C); -le syndrome adrénogénital (cortisone); -l’hémophilie A et B (le facteur VIII de la coagulation, le facteur IX de la coagulation); l’agammaglobulinémie (immunoglobulines); -l’hypothyroïdisme (thyroxine). Toutes ces méthodes de traitement ne font qu’améliorer partiellement, dans peu de cas, l’évolution dramatique des maladies génétiques.

3. En pharmacologie, la voie classique dans la recherche et dans la production des médicaments consiste à trouver et à fournir des substances capables de: -remplacer la protéine déficiente; -intensifier l’activité résiduelle de la protéine synthétisée en quantité réduite; -activer les facteurs qui fonctionneront à la place de la protéine déficiente; -inhiber ou d’éliminer les substances qui s’accumulent grâce à la protéine déficiente.

Ces agents thérapeutiques obtenus par le génie génétique incluent: -les produits des gènes normaux obtenus par le clonage et la réalisation de l’expression des gènes normaux dans des systèmes adéquats, pour obtenir la plus grande quantité possible de produits géniques médicaments; -les anticorps – les gènes des anticorps peuvent être manipulés pour obtenir de grandes quantités d’anticorps qui seront utilisés en tant qu’ agents thérapeutiques; -les vaccins contre le cancer et les agents infectieux. Les gènes humains clonés peuvent être utilisés en tant que sources pour obtenir des produits médicamenteux. Pour réaliser l’expression des gènes clonés, on les insère dans les cellules bactériennes. Celles-ci présentent l’avantage de pouvoir être cultivées en grandes quantités, en obtenant de grandes quantités de produit génique.

Par exemple, grâce à l’utilisation des microorganismes, on a obtenu les produits géniques suivants:  le facteur VIII de la coagulation, le facteur IX de la coagulation (l’hémophilie A et B), l’érythropoïétine (les anémies),  l’insuline (le diabète sucré insulino-dépendant),  le vaccin de l’hépatite B,  l’interféron alpha (la leucémie, les maladies hépatiques chroniques),  l’interféron bêta (les scléroses multiples), l’interféron gamma (la maladie granulomateuse chronique),  l’interleukine-2 (le cancer rénal), etc.

Maladie de Gaucher Pathologie provoquée par le déficit de l’activité d’une enzyme lysosomale, la glucocérébrosidase. L’absence de glucocerebrosidase provoque une accumulation de glucocérébroside dans les macrophages tissulaires Une atteinte multisystémique d’évolution imprévisible : atteintes hématologique, viscérales, et osseuses. Des degrés de gravité et des vitesses d’évolution extrêmement variables

Enzymothérapie substitutive par imiglucérase (Cerezyme®) 1991 : alglucérase, extraite de placenta humain 1997 : imiglucérase, enzyme recombinante maladie de Gaucher de type 1 et 3

Le traitement de la maladie de Gaucher L’enzymothérapie substitutive : traitement de référence Traitement par réduction de substrat : miglustat (limite l’accumulation du glucosylcéramide)

Le traitement de la maladie de Gaucher

Maladie de Gaucher Avant le traitement avec l’enzyme recombinante Même patiente, avec Dr Roscoe Brady, après le traitement

Ataxie de Friedreich-un espoir terapeutique?   L’ataxie de Friedreich est une affection neurodégénérative rare (prévalence de 1/50 000) pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement. Cette ataxie, débutant le plus souvent dans l’enfance ou l’adolescence, est progressive avec une perte d’autonomie après dix ans d’évolution. Elle a pour origine une amplification de triplet GAA dans le premier intron du gène codant pour une protéine dirigée vers les mitochondries appelée la frataxine. Le déficit en frataxine qui en résulte entraîne une signalisation défectueuse de certaines enzymes clés rendant les cellules hypersensibles à toute agression oxydative.

• Les inclusions sont terminées, les résultats sont prévus fin 2016. Etude de l’effet de la pioglitazone dans l’ataxie de Friedreich : étude preuve de concept (essai ACTFRIE) • Essai de phase III, interventionnel, prospectif, randomisé, mené en double-aveugle contre placebo, de thérapie pharmacologique (Essai NCT00811681) • Candidat médicament : la pioglitazone est un médicament connu pour activer un récepteur (PPAR), cette activation étant susceptible d’induire l’expression d’enzymes dont la superoxyde dismutase mitochondriale, impliquée dans l’ataxie de Friedreich. Elle pourrait donc avoir un effet bénéfique au plan thérapeutique.   • Les inclusions sont terminées, les résultats sont prévus fin 2016. • Objectif principal : évaluer l'efficacité de la pioglitazone comparativement à un placebo sur l'atteinte neurologique des patients atteints de maladie de Friedreich.

LA THÉRAPIE CELLULAIRE consiste dans l’ introduction de cellules indemnes dans l’organisme malade, afin d’améliorer les fonctions de la cellule déficiente. Les résultats obtenus à la suite de la transplantation de moelle osseuse (dans les leucémies) et de cellules musculaires (dans la dystrophie musculaire progressive de Duchenne) plaident en faveur des greffes de cellules indemnes. Le grand nombre de cellules qu’il faut administrer et les réactions immunes dues à la capacité de défense de l’organisme constituent des obstacles sérieux dans le développement de la thérapie cellulaire. La thérapie cellulaire présente l’avantage de ne pas nécessiter l’identification du gène mutant, ni de la protéine aberrante.

Maladie de Huntington -La thérapie cellulaire Un traitement par greffe de cellules foetales Les essais ont été effectués sur cinq patients. L'objectif est d'injecter des cellules pour reconstituer un réseau neuronal. Plusieurs étapes à cette thérapie : -Extraction des neurones d'un foetus de 7 à 9 semaines de vie intra-utérine. Ce neurones proviennent de l'éminence ganglionnaire, partie du système nerveux foetal qui devient le striatum -le tissu nerveux formé par ces neurones est découpé en petits cubes de 1 mm de diamètre -le tissu nerveux est injecté par le chirurgien à l'aide d'un cadre stéréotaxique permettant de repérer les structures internes du cerveau et de guider l'aiguille. Amélioration- 3 malades sur 5. AAaamélioré l'état de trois malades sur cinq, ceux dont les greffons sont actifs : récupération des fonctions motrices mais également amélioration des fonctions intellectuelles. Les chercheurs annoncent avoir amélioré l'état de trois malades sur cinq, ceux dont les greffons sont actifs : récupération des fonctions motrices mais également amélioration des fonctions intellectuelles Les trajectoir les greffons sont actifs : récupération des fonctions motrices mais également amélioration des fonctions intellectuelles. es sont définies dans le striatum par le neurochirugien : deux dans la tête du noyau caudé, deux dans le putamen. 40 microlitres de tissus nerveux sont déposés dans chacune de ces trajectoires. Les chercheurs annoncent avoir amélioré l'état de trois malades sur cinq, ceux dont les greffons sont actifs : récupération des fonctions motrices mais également amélioration des fonctions intellectuellese. Lncent avoir.

Dans le cadre de la mucoviscidose, la thérapie cellulaire consiste à implanter des cellules épithéliales saines dans le système respiratoire des patients Une première piste consiste à corriger le gène malade au sein de cellules souches pulmonaires adultes. Ces dernières pourraient alors produire des cellules saines. Pour le moment, aucune cellule souche humaine d'origine pulmonaire n'a pu être clairement identifiée. Plusieurs équipes de recherche dans le monde explorent cette piste qui semble plus complexe que dans d'autres organes. Une deuxième possibilité consiste à utiliser des cellules souches embryonnaires pour reconstituer un épithélium pulmonaire détruit. Même si les perspectives thérapeutiques semblent plus lointaines dans ce cas, une étape décisive a été franchie en 2005 par une équipe de l'INSERM basée à Reims. Ces chercheurs ont en effet régénéré un épithélium respiratoire complet à partir de cellules souches embryonnaires de souris. La perspective de développer une technique similaire chez l'homme est très séduisante et encourage le soutien de ces pistes de recherche thérapeutique.

La thérapie génique ou le transfert de gènes -représente le traitement d’une maladie génétique en introduisant dans l’organisme la version normale d’un gène déficient responsable de l’apparition de la maladie. L’utilisation d’un gène capable de coder la synthèse de la protéine déficiente offre de nombreuses applications potentielles, telles: la correction d’une maladie génétique en transférant un gène normal dans les cellules qui ne le possèdent pas;  l’inhibition ou la stimulation de l’activité d’un gène de sorte qu’il produise, au moment désiré et en quantité suffisante, la protéine indispensable.

La thérapie génique implique :  un gène à transférer (le gène thérapeutique, un fragment d’ADN),  une cellule cible et  un vecteur qui transporte le fragment d’ADN à l’intérieur de la cellule cible. En ce sens, un gène médicament doit être synthétisé en premier lieu, le gène thérapeutique. Plus ce gène est petit, plus il est facile à être obtenu et à être introduit dans le cellules cibles.

Thérapie Génique Thérapie Génique Objectifs Lymphocytes Fibroblastes Cellules endothéliales Kératinocytes Hépatocytes Myocytes Epithélium bronchique Cellules-souches médullaires Cellules cibles Corriger un déficit héréditaire Corriger un déficit génique acquis Programmer une cellule pour exprimer de nouvelles propriétés

Une méthode en 4 étapes : Isoler et cloner le gène d’intérêt thérapeutique, Réaliser un vecteur chargé d’amener le transgène dans le noyau cellulaire, Administrer le vecteur (in vivo, in situ, ex vivo), Vérifier l’intensité et la durée de l’expression du gène thérapeutique, mais aussi les effets secondaires éventuels.

Isolement du gène Protéine Option 1 Synthèse de l’ADN Transcriptase Séquençage des acides aminés Option 1 Synthèse de l’ADN Transcriptase inverse Option 2 ADN ARNm Gène souhaité Bibliothèque génomique Option 3 Sonde d’ADN

Si les cellules cibles de la thérapie génique sont facilement accessibles, l’introduction du gène thérapeutique dans les noyaux de celles-ci n’est pas difficile. Le gène médicament peut être administré au tissu affecté par injection directe, par voie sanguine ou par aérosols (la mucoviscidose). Les résultats obtenus par la thérapie génique “in vivo” ne sont pas satisfaisants, car le gène thérapeutique ne pénètre pas en quantités suffisantes dans les noyaux des cellules cibles. Un maximum de 1-2% des cellules cibles sont corrigées génétiquement. Pour que le gène médicament parvienne au noyau de la cellule cible, l’aide des vecteurs est nécessaire. Jusqu’à présent, on connaît deux types de vecteurs: viraux et inertes.

Les vecteurs viraux utilisés dans la thérapie génique sont les rétrovirus et les adénovirus. Les rétrovirus sont les premiers virus utilisés dans le transfert des gènes thérapeutiques. Les adénovirus, ayant une grande capacité de dissémination, sont considérés comme des instruments d’ élection pour le transfert de gènes. Adénovirus Rétrovirus

Pour intégrer le gène thérapeutique au génome viral, on supprime la partie de celui-ci qui contrôle le processus infectieux. On obtient ainsi un virus défectif. La partie supprimée du génome viral est remplacée par la séquence d’ADN du gène médicament;il en résulte un virus recombiné. Le virus recombiné, porteur du gène thérapeutique, est injecté dans un organe précis ou administré par voie sanguine pour pénétrer dans les cellules cible. Intégré au génome de la cellule cible, le gène fonctionnera en codant la synthèse de la protéine déficiente.

INRA

Pour infecter une cellule, la particule virale se fixe d'abord à la membrane cellulaire. Les gènes viraux sont libérés dans le noyau et, qu'ils soient intégrés ou non au génome cellulaire, ils utilisent la machinerie de réplication de la cellule pour produire de nouvelles particules virales. Ces dernières pourront aller infecter d'autres cellules. La grande difficulté rencontrée dans la thérapie génique à l ’aide des vecteurs viraux est de viser seulement les cellules affectées et d’obtenir l’expression maximale et durable du gène déficient.

Parmi les vecteurs appelés inertes, les liposomes ont été testés comme des transporteurs des gènes de petites dimensions. Les liposomes sont de petites vésicules sphériques qui ont une enveloppe artificielle lipide en double couche. Cette enveloppe, qui a une composition similaire à celle de la membrane cellulaire permet la fusion des liposomes avec celle-ci et le dégagement de leur contenu (le gène médicament) à l’intérieur de la cellule. Les liposomes sont administrés par injection dans la paroi abdominale, d’où ils sont emportés par l’intermédiaire des vaisseaux sanguins et diffusent dans l’organisme tout entier.

Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE HEREDITAIRES Pathologie Défaut génétique Prévalence Cible thérapeutique Immunodéficience ADA, X-SCID rare CSH ou lympho T Hemophilie A facteur VIII 1: 10.000 mâles foie, muscle Hémophilie B facteur IX 1: 30.000 mâles CSH, fibroblaste Hyper-cholestérolémie récepteur LDL 1:1.000.000 foie familiale Mucoviscidose CFTR (transporteur 1:3.000 cauc. poumon des ions chlores) Hémoglobinopathies: globine 1:600 (éthnie!) CSH anémie falciforme, thalassémie Maladie de Gaucher glucocérébrosidase 1:450 (éthnie!) CSH Emphysème héréditaire a-1 antitrypsine 1:3.500 foie et poumon

Maladies candidates pour la thérapie génique MALADIE ACQUISES Pathologie Prévalence Cible thérapeutique Cancer 1 million/an aux USA cellules cancéreuses ou dendritiques cellules présentatrices d'antigènes maladies dégénératives: Parkinson 1 million aux USA Alzheimer 4 millions aux USA neurones, cellules gliales désordres « immunologiques »: diabète de type I dizaines de millions cellules b du pancréas, autres… Cardiovasculaire: resténose, ATS dizaines de millions cellules endothéliales vasculaires maladies infectieuses: SIDA, hépatite B ou C centaines de millions CSH, hépatocytes

La thérapie génique est utilisée couramment dans les maladies héréditaires suivantes: La déficience de l’adénosine désaminase (ADA) dans laquelle les fonctions des lymphocytes T et des cellules stem hématopoïétiques sont altérées. La stratégie thérapeutique consiste dans le prélèvement des lymphocytes T des malades, leur multiplication dans des cultures cellulaires auxquelles s’ajoutent des rétrovirus vecteurs du gène ADA normal. Ce gène est intégré au génome des lymphocytes. Après la sélection des lymphocytes qui contiennent le gène ADA normal, ceux-ci sont transférés chez le malade à déficit ADA.

- L’hypercholestérolémie familiale . Les rétrovirus sont utilisés comme vecteurs des gènes qui codent la synthèse des récepteurs LDL. Dans l’hypercholestérolémie familiale on prélève chirurgicalement une portion d’un lobe hépatique et les cultures d’hépatocytes sont infectées avec les rétrovirus vecteurs des gènes pour les récepteurs LDL. Les hépatocytes modifiés sont sélectionnés et administrés chez les malades à l’aide d’un cathéter implanté dans le système port.

Hypercholestérolémie homozygote familiale (récepteur low-density lipoproteins -LDL-) Réimplantation Récolte Transfert de gène Culture Purification des hépatocytes Lobectomie 20%

Thérapie génique –la mucoviscidose Elle consiste à apporter le gène fonctionnel aux cellules et permettre la synthèse d’une protéine CFTR. Le gène est introduit dans les cellules grâce à des vecteurs d’origine virale (adénovirus) ou synthétique (liposomes). Ceux-ci sont administrés par bronchoscopie ou par la cavité nasale (aérosols). 26 essais ont été réalisés en Europe et aux Etats-Unis : les résultats sont encourageants mais modestes. Le gène est transféré, bien toléré, mais de manière transitoire.

La thérapie génique est la thérapie que tout le monde attend pour ce XXIème siècle. En 2010, les premiers succès sont encore modestes mais réels et concernent 4 maladies génétiques monogéniques.   1 : Le SCID (Severe Combined Immunodeficiency = Immunodéficience sévère combinée) des bébés bulle dépourvus de toute défense immunitaire 2 : La bêta-thalassémie, grave maladie des globules rouges du sang 3 : L'adrénoleucodystrophie, gravissime maladie du cerveau dont les neurones se détruisent 4 : L'amaurose de Leber, une maladie qui touche la rétine

L'adrénoleucodystrophie liée à l'X (ALD) est une maladie qui se manifeste par une démyélinisation progressive du système nerveux central (perte de la gaine lipidique qui entoure les neurones qui dégénèrent) ou une insuffisance surrénale périphérique. Une infirmité totale peut parfois gagner les enfants atteints, essentiellement des garçons. Cette maladie gravissime et rarissime (une naissance sur 20 000) est monogénique et due à un allèle muté du gène ABCD1 porté par le bras long du chromosome X.

Dans le cancer, la stratégie thérapeutique la plus fréquente est celle qui détermine la mort des cellules cancéreuses.  les gènes thérapeutiques sont introduits dans les cellules cible et leur produit génique entraîne la mort de celles-ci. On peut obtenir la mort directe des cellules cible, lorsque les gènes insérés produisent des toxines léthales (les gènes suicide) ou les gènes insérés codent la synthèse d’un promédicament qui confère la susceptibilité à la mort cellulaire consécutive à l’administration du médicament;  la mort indirecte des cellules, en utilisant des gènes immunostimulateurs qui déclenchent ou qui inhibent la réponse immune;

l’inhibition de l’expression des gènes, à l’aide du blocage par l’intermédiaire des oligonucléotides antisens de la transcription et / ou de la traduction du gène anormal. Les oligonucléotides antisens sont des fragments courts d’acides nucléiques, capables de se fixer par complémentarité sur la molécule d’ADN ou d’ARNm. La fixation d’un ARN antisens sur l’ARN messager du gène anormal empêche la traduction du dernier en protéine. Les oligonucléotides ADN antisens se fixent directement sur la double hélice de l’ADN mutant, bloquant la transcription de l’ARN messager.

En oncologie, la thérapie génique est utilisée dans le traitement des formes suivantes de cancer:  le cancer mammaire,  le cancer colorectal,  les mélanomes,  la leucémie,  le cancer pulmonaire,  le cancer rénal et  le cancer du cerveau.

Thérapie génique-conclusions Obstacles à surmonter : Trouver un vecteur capable d’infecter les cellules mais non détruit par le système immunitaire, et capable de transférer le gène de manière durable. Cibler les cellules que le vecteur doit atteindre. Vérifier que la technique est sans danger pour les patients et son environnement.

L’examen du cours consiste en une épreuve écrite qui va comprendre la matière de cours. Vous aurez 42 questions à choix unique. Chaque question aura une seule variante juste. Vous passerez l’examen du cours à condition d’obtenir minimum 50 points à l’examen écrit . Samedi 11 juin 2016 – amphi. Moldovan -a 8h et 30- les groupes 1,2,3,4 - a 10h- les groupes 5,6,7,8 L’examen oral- a 10 h-le groupe 2 - a 12 h - les groupes 1,3,5 ,6 - a 14 h et 30 - les groupes 4,7,8