Q. Exemples de luminescences? CM1 :Introduction-généralités sur la fluorescence I. phénomènes de luminescence Consécutive à - photoluminescence une excitation lumineuse fluorescence phosphorescence - Chimiluminescence - Bioluminescence - Thermoluminescence - électroluminescence une réaction chimique Une réaction enzymatique … Q. Exemples de luminescences?

Exemples de bioluminescence Camouflage, Attraction Repulsion Communication

Applications de la Bioluminescence Firefly luciferine + luciferase + ATP + O2 oxyluciferine + luciferase + AMP + light luciferine + aequorine + Ca2+ oxyluciferine + aequorine-Ca2++ light Coelenterazine

Exemples de chimiluminescence 1. objets décoratifs (cyalume). 2.études environnementales: détection du CO2 qui réagit bien avec le luminol. 3.nombreuses applications médicales 4. Police scientifique (*) (*) -toxicologie : recherche de poisons -balistique : nature et la trajectoire de balle -identification des explosifs ayant un ou plusieurs groupements NO2 (ex: TNT, Nitroglycérine etc.) -détections d’incendies -traces de sang effacées (2003 « Blue star », produit dérivé du luminol: réagit avec les ions fer des globules rouges)

matière – rayonnement électromagnétique Interaction matière – rayonnement électromagnétique Elastique (Rayleigh) Inélastique (Raman, Brillouin) Diffusion Émission de chaleur Absorption Photoluminescence fluorescence phosphorescence Loi de Bohr DEmol=hn hn = hc/l h= 6,62.10-34 J.s constante de Planck = fréquence de l’onde EM (Hz) c = 3.1010 cm.s-1 vitesse de la lumière l = longueur d’onde (nm) s =1/ l nombre d’onde (cm-1)

Q. Le néon…quel type de luminescence est-ce? Q. applications de Fluorescence en biologie?

Développement des méthodes de fluorescence

Remarque

II. Principe de la fluorescence: cas d’une molécule isolée X et Diagramme de Jablonski simplifié 2. L’énergie de (S1’) est partiellement dissipée soit sous forme de chaleur (ou bien par transfert d’énergie entre X et d’autres molécules si X NON isolé) Déplacement du spectre d’émission vers l + élevée que spectre d’absorption La différence d’énergie (hνEX-hνEM) représente le shift de Stokes

Diagramme de Jablonski simplifié Q. photon émis avec longueur d’onde plus grande ou plus petite?

Diagramme de Jablonski simplifié : fluo et phosphorescence Q. Pourquoi les états électroniques sont appelés Singulets (S0 ,S1 ,S2) ou triplets (T1, T2)?

les états électroniques Singulets (S0 ,S1 ,S2) ou triplets (T1, T2)… les états électroniques Singulets (S0 ,S1 ,S2) ou triplets (T1, T2)….pour info:

Temps caractéristiques des divers processus radiatifs et non radiatifs Diagramme de Jablonski Résumé des processus de désexcitation d’une molécule polyatomique après absorption UV Temps caractéristiques des divers processus radiatifs et non radiatifs Processus t commentaire absorption 10-15 s Relaxation vibrationnelle (IVR) 10-12- 10-10 s fluorescence 10-9- 10-7 s Durée de vie radiative de l’état excité S1 Croisement intersystème (ISC) 10-10- 10-8 s Conversion interne (IC) 10-12- 10-9 s phosphorescence 10-6- 1s ou plus... Durée de vie radiative de l’état excité T1

t=Durée de vie à l'état excité Q. Quelles sont les grandeurs nécessaires pour caractériser un fluorophore? t=Durée de vie à l'état excité lém

e=Coefficient d'extinction (ou absorption molaire) DO = elc les grandeurs nécessaires pour caractériser un fluorophore (suite) lexc, e=Coefficient d'extinction (ou absorption molaire) DO = elc Q. Quelle est l’unité de e?

Caractéristiques des fluorophores Résumé des grandeurs nécessaires pour caractériser un fluorophore: t Caractéristiques des fluorophores Longueurs d'onde correspondant aux pics des spectres d'excitation et d'émission Coefficient d'extinction (ou absorption molaire) = relie la quantité de lumière absorbée à une longueur d'onde donnée à la concentration du fluorophore en solution (M-1 cm-1) Rendement quantique = efficacité relative de la fluorescence comparée aux autres voies de désexcitation (= Nb photons émis / Nb photons absorbés) Durée de vie à l'état excité = temps moyen où la molécule reste à l'état excité avant de retourner à son état basal (psec) lexc, e lém Rendement quantique f = Nbre de photon émis / Nbre de photon absorbés)

Q. Comparaison entre spectre d’absorption Spectre d’excitation et spectre d’émission de fluorescence? Spectre d’émission de fluo

Spectre d’émission et d’absorption: shift de Stockes et miroir

1. effet du solvant= relaxation du solvant Shift de Stokes =déplacement vers le rouge (DE + faible) du spectre d’émission de fluo./ spectre d’abs (Cf. diagramme de Jablonski) Dû à relaxation de l’état excité S1 (retour vers des niveaux vibrationnels de S1 plus bas en énergie) Phénomènes contribuant au passage de S1 à S1’ plus bas en énergie : 1. effet du solvant= relaxation du solvant Général (modification de µ* par rapport à µ Réorientation du solvant autour de X*) Toujours présent particulier (interactions chimiques spéciales ex: liaisons hydrogènes, complexation..) 2. réactions à l’état excité telles que collision (gaz à faible concentration peut ne pas présenter de shift)

Règle de l’image miroir entre spectre d’abs et spectre d’excitation Principe de Franck-Condon: transitions électroniques sans changement de position des noyaux i-e pas de changement vibrationnel au niveau des liaisons entre état excité et état fondamental d’une molécule phénomènes qui perturbent « l’image miroir »: Arrangements géométrique entre état S0 et S1 - Réaction de X* avec d’autres molécules (excimères exiplexes..etc)

III. Exemples de fluorophores Molécule  lmax(nm) e.10-3(M-1.cm-1)  Trp  280   219  5,6    47,0  Tyr 274   222    193  1,4    7,0    48,0  Phe 257   206     188  0,2    9,3    60,0  His  211  5,9 Cys  250  0,3 Adénine  260,5  13,4 Adénosine  259,5  14,9 Guanine  275  8,1 Cytosine  267  7,1  Uracil  8,2  Thymine  264,5 7,9 DNA  258  6,6 (par base)  RNA  258 7,4 (par base)

Substance l(nm) ex10-3  F  tF(ns) Sensibilité  Trp    280 5,6 348 0,20 2,6 11 Tyr   274 1,4 303 0,14 3,6 2,0 Phe 257 0,2 282 0,04 6,4 0,08 A 260 13,4 321 3.10-4 <0,02 <0,032 G 275 8,1 329 <0,024 C 267 6,1 313 8.10-5 <0,005 U 9,5 308 4.10-5 <0,004 NADH 340 6,2 470 0,019 0,40 1,2

Absorption and fluorescence spectral ranges for 28 fluorophores of current practical importance. Some important excitation source lines are indicated on the upper horizontal axis.

Quantum dot: la lumière émise dépend de la dimension des nano-particules 443 473 481 500 518 543 565 587 610 655 nm on peut couvrir toute la gamme optique de l’Infra-Rouge (CdTe, InAs) à l’Ultra-Violet (ZnSe)

Avantages des Quantum Dots par rapport aux fluorophores organiques (rhodamine) ou biologiques (GFP) même taille que les protéines 120 fois plus brillant - 100 fois plus stable - raies plus fines (1/30)

IV. Conclusions sur le Diagramme de Jablonski Conséquences des ordres de grandeurs de Durées de vie, temps de relxation: Processus t Conséquences absorption 10-15 s 1. Les noyaux n’ont pas le temps de bouger généralement mais e- peuvent bouger : principe de Franck-Condon 2. L’absorption sera seulement sensible à l’environnement immédiat…ex enveloppe de solvant Relaxation vibrationnelle (IVR) 10-12- 10-10 s fluorescence 10-9- 10-7 s 1. Spectres d’émission de fluo généralement indépendant de l exc 2. CI rapide généralement finie avant fluo Conversion interne (IC ou CI) 10-12- 10-9 s Croisement intersystème (ISC) 10-10- 10-8 s phosphorescence a moins de probabilité d’être observé….(cf dia suivante**) phosphorescence 10-6- 1s ou plus...

Mais d’autres phénomènes en même temps molécules peuvent avoir le temps d’effectuer des mouvements translationnel ou rotationnels Ex diffusion en solution ou ds mb en bio molécule d’O2 peut diffuser de 70 A° en 10-8 s ! Collisions avec quenchers Formations de complexes avec solvants , solutés (cf. conséquence n°3) réorientation de l’environnement autour de l’état excité (cf. conséquence n°2) Applications en biologie: De nb processus dynamiques peuvent être suivis par leurs effets sur - FF - tF - Spectre d’émission - (Anisotropie de fluo)

Q. Pourquoi les molécules qui absorbent ne sont pas tous des fluorophores? + autres voies de désexcitation non radiatives Exemples:

Q.(**) Pourquoi observe t-on peu les phénomènes de phosphorescence (pourquoi l’ISC est-il si lent)?

V. Schéma TRES simplifié d’un spectrofluorimètre:

Fin de CM1