L'hémolyse Post-Transfusionnelle Retardée du Drépanocytaire : un Accident sous-estimé, un Mécanisme non Anticorps-Dépendant Philippe Chadebech1, Anoosha Habibi2, Ruben Nzouakou2, Meunier-Costes Natacha1, Dora Bachir2, Philippe Bonin1, Btissam Chami1, Frédéric Galactéros2, Philippe Bierling1, et France Noizat-Pirenne1* (1) Etablissement Français du Sang, Ile-de-France, Hôpital Henri-Mondor, Créteil. (2) Unité des Maladies Génétiques du Globule Rouge, Hôpital Henri-Mondor, Créteil. *e-mail : france.noizat-pirenne@efs.sante.fr CONTEXTE ET BUTS DE L’ETUDE  L’Hémolyse Post-Transfusionnelle Retardée (“Delayed Hemolytic Transfusion Reaction“, DHTR) est une complication sévère de la Drépanocytose (SCD). Elle peut engager le pronostic vital. Certaines caractéristiques se retrouvent fréquemment : destruction à la fois des globules rouges (GR) homologues transfusés et de ceux du patient ; hémolyse stimulée par des transfusions ultérieures ; récurrence des complications classiques de la maladie (crise vaso-occlusive [CVO], syndrome thoracique aiguë [STA]) ; quelques cas sont rapportés sans présence d’anticorps anti-GR (1,2).  Cette étude prospective vise à clarifier les mécanismes de la DHTR non anticorps-dépendante. A cette fin, nous nous sommes particulièrement intéressés à l’exposition de la phosphatidylsérine (PS) sur les GR (autologues et homologues transfusés) et son implication dans ce mécanisme d’hémolyse. L’exposition de la PS, un des signaux de l’apoptose du GR ou eryptosis, conduira à la destruction physiologique de ces GR en circulation, notamment via un PS-récepteur présent sur les macrophages (3). PATIENTS ET MÉTHODES  48 patients SCD ont été suivis, dans une étude prospective et longitudinale, durant un épisode transfusionnel, soit dans un programme transfusionnel, soit à l’occasion d’un événement clinique nécessitant une transfusion. Les unités transfusées sont compatibles ABO, RH, KEL ; le choix des unités est fait en fonction des allo-anticorps, présents ou antérieurs, connus. Les analyses ont été effectuées à 5 points différents (en pré-transfusionnel [jour 0] et post-transfusionnels [jours 0-3, 5± 2, 10 ± 2, 20 ± 5]) et comprenaient : NFS, dosage des marqueurs d’hémolyse, taux d’Hb totale et HbA, recherche d’anticorps anti-GR (cartes-gel, Diamed) dans les plasmas et éluats, compatibilité des GR transfusés (face aux sur plasmas et éluats collectés), Coombs direct étendu (cartes-gel anti IgG, IgA, IgM, C3d, C3c).  Les % de GR positifs pour la PS (GR-PS+) sont déterminés par cytométrie de flux (FACScan, BD) avec un kit de marquage à l’AnnexineV-FITC (Dako) : in vitro sur des GR issus de poches (GR donneurs) incubés 48h à 37°C, dans des plasmas pré-transfusionnels de patients ou de donneurs sains ; in vivo sur des GR isolés à partir des échantillons de patients collectés aux différents points. RÉSULTATS SUIVI BIOLOGIQUE DES 3 CAS DE “DHTR“ Parmi la cohorte étudiée, 3 patients admis pour CVO et transfusés, ont présenté un épisode de DHTR. L’Hb totale (; g/dL), le taux d’HbA (; %) et les réticulocytes (histogrammes ; 10*9/L) sont indiqués. Après 7 à 13 jours, l’HbA circulante a disparue, reflétant ainsi la destruction des GR transfusés. Les réticulocytes élevés ne compensent pas la diminution de l’Hb totale, traduisant également une destruction des GR autologues. Patient (2) 2 4 6 8 10 12 1 5 7 11 21 20 30 40 50 60 70 220 135 180 333 202 Taux d’Hb A (%) Hb totale (g/dL) Patient (1) 13 393 405 412 437 470 3 19 63 191 277 Patient (3) Suivi (Jours) RENDEMENT TRANSFUSIONNEL DE LA COHORTE non-CVO 10 20 30 40 50 Taux d’HbA (%) 0 - 3 5 ± 2 10 ± 2 20 ± 5 0.5 24.2 27.8 25.2 21.0 CVO ± STA 1.2 23.6 28.8 27.0 23.1 Suivi (Jours) DHTR 0.1 33.2 22.6 3.3 Comparaisons des taux d’HbA (%) attestant du rendement transfusionnel durant le suivi et de la persistance des GR transfusés, pour chaque indication d’inclusion. Les moyennes sont indiquées. L’indication de transfusion n’a pas d’impact sur le rendement transfusionnel ; le taux d’HbA circulante reste stable, jusqu’à 25 jours après transfusion, pour les patients transfusés pour CVO ± STA (n=13) ou pour d’autres indications (non-VOC; n=16). Pour les 3 patients DHTR, le taux d’HbA chute dramatiquement sur la même période. IN VITRO : MESURE DES GR-PS+ (%) APRÈS INCUBATION DANS DIFFÉRENTS PLASMAS (A) Dot plots et histogrammes représentatifs, montrant les modifications de taille (FSC) et d’exposition de la PS, après incubation des GR issus de poche dans différentes catégories de plasma (panel du haut). Le volume moyen des GR analysés (milieu) et le % des GR positifs pour l’AnnexineV (bas) sont indiqués. (B) Valeurs de GR-PS+ obtenus (moyenne ± SD) après incubation 48h, 37°C dans les différentes catégories de plasmas : donneurs sains (n=11), CVO ± STA (n=13), autres indications (non-CVO ; n=16) et DHTR sans anticorps (n=2). Les niveaux de GR-PS+ (%) augmentent après incubation des GR de poches avec des plasmas pré-transfusionnels de patients drépanocytaires en CVO (± DHTR). Une telle augmentation n’est pas observée face aux plasmas de patients transfusés pour d’autres indications (non-CVO), ou de donneurs sains. Les valeurs mesurées face à l’ensemble des patients inclus pour CVO est plus importante dans le cas des 2 patients DHTR sans anticorps, comparés aux échantillons CVO ± STA. Cette augmentation des GR-PS+ s’accompagne d’une diminution globale du volume des GR (histogrammes FSC ; Moy). 30.4 % 22.1 % 6.8 % Annexine-FITC Nombre 0.7 % FSC Donneur sain non-VOC CVO ± STA DHTR Moy. 407 Moy. 297 Moy. 313 Moy. 373 A 10 20 30 40 50 1.9 4.7 12.8 37.1 GR-PS+ in vitro (%) p=0.048 p=0.0071 B Patient (1) Jours 1 5 8 13 20 Bili. 38 37 75 219 80 42 LDH 376 414 768 490 302 IH - SUIVI BIOLOGIQUE DES 3 CAS DE “DHTR“ Résumé du suivi biologique, sur 19 à 21 jours après transfusion, des 3 patients présentant une réaction de DHTR ; les taux de bilirubine (Bili.; mg/dL), LDH (UI/L) et les résultats immuno-hématologiques (IH) sont indiqués. Les niveaux élevés de Bili. et LDH traduisent une hémolyse des GR. Les analyses IH (résumées ici) démontrent l’absence d’anticorps détectables pour les patients (1) et (2). Dans le cas du patient (3), le Coombs direct apparait positif dès J6 ; la spécificité de l’anticorps détecté dans l’éluat n’a pas pu être caractérisée. Patient (2) Jours 1 5 7 11 21 Bili. 40 42 39 50 15 37 LDH 1024 824 486 1213 591 316 IH - 2 4 6 8 0-3 5 ± 2 10 ± 2 20 ± 5 Suivi (Jours) Taux de GR PS+ in vivo (facteur d’augmentation) p=0.009 p=0.007 non-DHTR DHTR IN VIVO : MESURE DES GR-PS+ (%) AVANT ET APRÈS TRANSFUSION Taux des GR in vivo positifs à l’AnnexineV (GR-PS+) pour les patients ne présentant pas de DHTR (et inclus pour CVO ± STA ou autres indications cliniques) (non-DHTR ; n=28) et les patients DHTR (n=3) durant le suivi (moyennes ± SD). Les niveaux de GR-PS+ mesurés sont normalisés ; la valeur de 1 correspond au J0 avant transfusion. À J10 ± 2 et J20 ± 5, le facteur d’augmentation observé pour les patients DHTR est significativement plus élevé (3.74 ± 2.0 et 4.85 ± 1.4, respectivement) que pour les patients non-DHTR, pour qui les taux de GR-PS+ restent globalement stables (1.25 ± 0.4 et 1.27 ± 0.7, respectivement). Patient (3) Jours 3 6 7 10 19 Bili. 94 55 67 68 33 20 LDH 665 395 561 937 1194 623 IH - DAT+ DISCUSSION  Durant notre suivi, 3 patients ont subi une réaction de DHTR, confirmée par la disparition rapide de l’HbA circulante et des paramètres d’hémolyse élevés. Des signes cliniques typiques (récurrence de la crise) sont observés au moment de l’hémolyse dans les trois cas. Les patients (1) et (2) ne présentent pas d’auto- ni d’allo-anticorps détectables. Chez le patient (3), la présence d’un test de Coombs positif IgG dès J6, implique qu’une destruction anticorps-dépendante des GR ne peut être totalement exclue.  In vitro, nos résultats montrent que les GR issus de poche, et transfusés, peuvent subir des dommages dus à l’environnement présent chez les patients SCD en CVO ou STA. La survie de ces GR homologues est ainsi compromise. Le stress oxydatif généré par la CVO pourrait interférer avec la machinerie cellulaire responsable de l’exposition de la PS à la surface des GR (issus de poches et provenant de donneurs). Les raisons pourraient être la présence de radicaux libres ou la diminution du NO libre disponible (4).  Chez deux patients, nous décrivons une destruction précoce et accélérée des GR transfusés et un mécanisme d’hémolyse sans anticorps détectable. Ces 2 patients présentent aussi les valeurs de GR-PS+ les plus élevées in vitro, suggérant que le contexte oxydatif présent chez ces 2 patients en DHTR pourrait être plus délétère que chez les autres patients sous CVO. Les résultats obtenus in vitro suggèrent aussi qu’un programme transfusionnel conduit à un environnement plus favorable à la transfusion de GR homologues. RÉFÉRENCES (1) Win N, New H, Lee E, de la Fuente J. Hyperhemolysis syndrome in sickle cell disease: case report (recurrent episode) and literature review. Transfusion. 2008 (2) Petz LD. Bystander immune cytolysis. Transfus Med Rev. 2006 (3) Lang F, Lang KS, Lang PA, Huber SM, Wieder T. Mechanisms and significance of eryptosis. Antioxid Redox Signal. 2006 (4) Nicolay JP, Liebig G, Niemoeller OM, Koka S, Ghashghaeinia M et al. Inhibition of suicidal erythrocyte death by nitric oxide. Pflugers Arch. 2008 (5) Hod EA, Sokol SA, Zimring JC and Spitalnik SL. Hypothesis: Hemolytic transfusion reactions represent an alternative type of anaphylaxis. Int J Clin Exp Pathol. 2009 CONCLUSIONS  Dans cette étude, nous démontrons clairement que le processus de DHTR peut survenir sans anticorps détectable. En se basant sur des données d’exposition de la PS sur les GR, in vitro et in vivo, nous proposons un scénario dans lequel les GR homologues, transfusés dans un contexte de haut stress oxydatif (CVO), subissent un processus d’eryptosis. (5)  La réaction d’hémolyse des GR transfusés induit une cascade d’événements qui augmente le relargage de médiateurs du stress oxydatif, entrainant ainsi la destruction des GR autologues, fragiles. Une nouvelle transfusion conduirait à une nouvelle vague d’hémolyse qui amplifie ces conséquences. Le seul moyen de rompre cette boucle est de stopper les transfusions. Restent à déterminer les médiateurs qui induisent et accélèrent l’eryptosis des GR transfusés afin d’envisager une prévention adaptée.