Logos Logos Phu Phu Phu Phu INFOS Synthèse Chimique Canal KcsA Technique : Synthèse d’ADN Découvertes : 1960 Inventeur : H. Gobind Khorana Rôle : Créer une séquence spécifique INFOS

Logos Logos Phu Phu Phu Phu PRESENTATION Synthèse Chimique Canal KcsA Les techniques expérimentales ont fait d’énormes progrès depuis quelques années, et ont permis de réaliser les théories imaginées par les chercheurs du 20e siècle. Ces manipulations ont permis l’explosion de la recherche biologique au cours des dernières années avec l’exploration des génomes, allant même jusqu’à décrire les structures 3D des protéines par cristallographie à rayons X. La synthèse des oligonucléotides a également permis cette explosion en améliorant les techniques de clonage, la PCR… Nous allons donc étudier cette technique qui permet d’élaborer une chaine de nucléotides voulue, pour ensuite être utilisée dans différentes techniques de biologie. Contrairement aux polymérases cette séquence est synthétisée en 3’ vers 5’ à partir d’un nucléotide fixé à une bille.   PRESENTATION

Logos Logos Phu Phu Phu Phu MANIPULATION Synthèse Chimique Canal KcsA Elle s’organise en 4 phases qui forme un cycle, correspondant à l’addition d’un nucléotide sur la séquence, et se répète pour obtenir une séquence complète. Le côté 5’ des nucléotides est protégé par un Diméthoxytrityl (DMTO) que l’on doit d’abord enlevé. • Déprotection : Le groupe DMTO est éliminé par une solution d’acide trichloroacétique, ce qui laisse apparaitre une coloration orangée due au DMTO libre que l’on mesure par spectrométrie. • Couplage : Ensuite on ajoute notre nucléotide phosphoramidite (possède un phosphite triester en 3’) qui réagit avec l’extrémité 5’ en présence de tétrazole pour accélérer la réaction. Nécessite de l’acétonitrile comme solvant apolaire puisque la réaction est sensible à l’eau. MANIPULATION

Logos Logos Phu Phu Phu Phu MANIPULATION Synthèse Chimique Canal KcsA • Blocage : Pour bloquer les nucléotides qui n’ont pas réagi en 5’, de l‘anhydride acétique est ajouté pour empêcher les extrémités avec un OH libre de réagir. • Oxydation : La liaison phosphite étant instable, il est nécessaire d’ajouter du diiode dans du tetrahydrofurane pour apporter un oxygène, et stabiliser la liaison. Ceci conclut le cycle qui se répète jusqu’à la fin de la séquence. Le premier nucléotide en 3’ est ensuite détaché de la bille lors de la dernière déprotection. A noté que plusieurs billes sont utilisées en même temps pour obtenir plusieurs fois la séquence. Le rendement est de 98- 99% et nécessite donc une purification pour éliminer les mauvaises chaînes et une partie des produits utilisés (notamment l’ammoniac). MANIPULATION