NAMC, équipe communication chimique Université Paris Sud, bât 446 Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) Par Helena ALVES- REMY NAMC, équipe communication chimique CNRS, UMR 8620 Université Paris Sud, bât 446 ORSAY. Octobre 2004
LIPIDES Définition : Molécules insolubles dans l’eau, mais solubles dans les solvants organiques non polaires comme l’éther, le chloroforme, le méthanol ou le cyclohexane.
Lipides simples : Alcools, aldéhydes, acides, esters gras Acylglycérols (MG, DG, TG) Stérols Hydrocarbures (alcanes, alcènes, ß-carotène,..) Quinones (vit. K, coenzyme Q) Céramides Cires Lipides aminés (dopamine,…)
Lipides complexes : Phospholipides (PE, PI, PC, PS, SM, …) Glycolipides (groupes sanguins,…)
Mise en évidence des différentes classes de lipides Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou Thin Layer Chromatography (TLC)
Chromatographie Définition: Méthode de séparation des constituants d’un mélange qui utilise deux phases non miscibles: Une phase stationnaire qui établit des liaisons +/- fortes avec les molécules à séparer Une phase mobile qui entraîne et décroche les molécules retenues sur la phase stationnaire.
CCM lipides Phase stationnaire = Gel de silice Phase mobile = 4 mélanges de solvants différents Visualisation des spots: sous UV après vaporisation de Primuline. Migration
Lipides totaux transportés par la lipophorine Lipophorine: lipoprotéine hémolymphatique spécialisée dans le transport des lipides chez les insectes. Lipides totaux extraits par un mélange Méthanol – Chloroforme (1:2, v/v).
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE PC
Identification individuelle de chaque lipide Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou GC-MS
Chromatographie en phase gazeuse ou CPG: Phase mobile = éluant gazeux inerte (He, H2, N2) qui entraîne le mélange à analyser. Phase stationnaire, fixée sur un support inerte, retient +/- les constituants du mélange.
Injection à haute température CPG s’applique aux gaz et aux composés susceptibles d’être vaporisés sans décomposition à haute température
Réactions de dérivation des lipides Alkylation; Silylation En masquant les fonctions polaires, elles permettent d'augmenter: la volatilité la stabilité la détectabilité
Alkylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements alkyles
Silylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements triméthylsilyl ou tert-butyl-diméthyl-silyl (t-BDMS)
Séparation des lipides dans la colonne capillaire
Phase stationnaire Phase stationnaire apolaire de type BP-X5 = Polymethylphenylsiloxanes
Le détecteur de masse
Electrons cibles de l’impact électronique Électron arraché, par ordre de préférence: 1) électron des doublets n (O, N, …) 2) électron Π (double liaison) 3) électron σ Réarrangements moléculaires Rupture de liaisons Les fragments chargés + sont détectés.
Acides gras libres (AGL) avant dérivation :
Esters méthyliques d’acides gras :
AGL après silylation :
Standard de distéarine après silylation
Spectre de la tricaprine
TG composé de 3 AG différents
Mécanismes de fragmentation des acyl-sn-glycérols:
1,3-dimyristine
1,2-dimyristine
Hydrocarbures ramifiés: Formation de carbocations secondaires
Localisation des doubles liaisons: dérivation au DMDS
Spectre du 7-pentacosène
5,9 Heptacosadiene Phéromones chez Drosophila melanogaster Femelle 1 7 8 11 12 27 CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)14-CH3 5,9 Heptacosadiene 1 5 6 9 10 27 CH3-(CH2)3-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)16-CH3
Phéromones chez Drosophila melanogaster Mâle
Identification des phospholipides 1) identification du type de PL par CCM grâce à la co-migration de standards 2) identification des AG estérifiés par GC-MS
Lipides transportés par la lipophorine Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1,3 DG 1,2 Stérols MG PE PC
Analyse des spots correspondant à PE et à PC par GC-MS
L’analyse des lipides par GC-MS permet : d’identifier les AG libres d’identifier les AG estérifiés dans les MG, DG, TG et PL de distinguer entre DG 1,2 et 1,3 d’identifier les hydrocarbures de localiser la position d’une ramification de localiser la position d’une double liaison d’identifier les stérols