La Cytométrie en flux.

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Transcription de la présentation:

La Cytométrie en flux

La cytométrie en flux La Cytométrie Le Flux Comparaison d’échantillons Mesure des cellules Comparaison d’échantillons Paramètres physiques Paramètres chimiques (sondes fluorescentes) Paramètres biologiques Microscope, photos numériques Le Flux Dénombrement de particule Passage une à une devant le détecteur Liquide en mouvement

La cytométrie en flux Le Principe La focalisation hydrodynamique Le laser La focalisation hydrodynamique La focalisation du laser La diffraction du laser Séparation des signaux Les résultats

La cytométrie en flux Le principe : le laser laser Argon 488nm Raie lumineuse monochromatique Un seul type de photons (dans le bleu) Forme elliptique après focalisation Faisceau d’éclairement très concentré COULTER® EPICS® XL

La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique P2>P1 P2 d1 d1 >> d2 d2

La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique Manchon liquidien : 50 à 100 µm Suspension cellulaire :10 à 15 µm 100 12 1 ml de cellules 106/ml: 12 µm de diamètre colonne de cellules de 9 km 1 cellule / 0.9 cm

La cytométrie en flux Le principe : la focalisation du laser FOCALISATION LASER Le diamètre d'un faisceau laser : 0,7 mm peu précis Lentilles de focalisation 2 lentilles permettent de focaliser le laser de manière à obtenir un faisceau elliptique proche, en taille, des événements à analyser : TRES PRECIS

La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale e-V photodiode

La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale Diffusion dans l’axe Forward scatter (FS, FSc) Diffraction ++ Réflexion +/- Réfraction +/- Taille des particules

La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale Réflexion Réfraction

La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale Diffusion à angle droit Side scatter (SS, SSc) Diffraction - Réflexion ++ Réfraction + Hétérogénéité du contenu cellulaire

La cytométrie en flux Le principe : la diffraction du laser Diffusion axiale Laser Diffusion latérale + fluorescence

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux Spécificité relative Fluorochrome spécifique pour un constituant de la cellule Toutes les cellules marquées Ac.Nucléiques Protéines Ions Spécificité absolue Fluorochrome lié à une molécule biologique Substrat fluorogène Ligands: FC, AnV, lectines Anticorps

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux Sondes fluorescentes: plusieurs fluorescences pour chaque cellule Filtres optiques Fluo1 Fluo2 Fluo3

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux Filtres colorés absorbants Filtres interférentiels Miroirs dichroïques

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux 500nm 800nm 700nm 600nm FITC PE ECD PECy5 Emission Relative Fluorescence 

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux D1, D2, …: photomultiplicateurs

La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux

La cytométrie en flux Les résultats : la chaîne d’acquisition PMT eV h 0V 10V Ampli CAD 1023 0000000000 0000000001 0000000010 1111111011 1111111111 1111111110

La cytométrie en flux Les résultats : Digitalisation / Histogramme Intensité du signal 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1023

La cytométrie en flux Les résultats : analyse d’histogramme intensité de fluorescence 1023 N % Moy, CV, ...

Histogramme de Distribution Spectre de fluorescence - graphe - courbe - profil Histogramme de Distribution N intensité Spectre de fluorescence intensité 

La cytométrie en flux Les résultats Représentation des résultats sous forme d’histogrammes de distribution de fréquence. Analyses de populations dans des échantillons hétérogènes ? moy

La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique 1 2 3 4 N Paramètre 1 Paramètre 2

La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique

La cytométrie en flux Les résultats : Combinaison de paramètres

La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement de l’analyse Diffusion Axiale Diffusion latérale Diffusion Axiale Diffusion Axiale Diffusion Axiale

La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement couleur Diffusion latérale Diffusion axiale Diffusion latérale Diffusion axiale

La cytométrie en flux Synthése fluo2 fluo3 électronique fluo1 diffusion laser

La cytométrie en flux Les résultats : immunofluorescence Excellente spécificité (Ac) théorique Nombreux contrôles nécessaires Spécificité de l’Anticorps Fixation non spécifique pour l’antigène Affinité

La cytométrie en flux Les résultats : Le contrôle négatif Lecture dérivée des observations au microscope 1 Ac négatif Ac marqueur 2

La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8 Sang Lyse des GR Diff. Latérale Diff. Axiale Anti-CD8 Anti-CD4

La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8 65% 20%

La cytométrie en flux Applications : Analyse des leucémies Diffusion latérale CD45 Leuco Ery

La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire Marqueurs de l’ADN Intercalants Spécificité relative

La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire G1 M Colc G1 M Fluorescence proportionnelle à ADN Cam G1 M Dnr G1 M

La cytométrie en flux Applications : Analyse de l’apoptose Marqueurs membranaires Marqueurs mitochondriaux Marqueurs enzymatiques

La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC -phospatidylsérines Intactes -Annexine V-FITC Apoptose rouge Nécrose Iodure de propidium vert

La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC / IP Témoin CHX Apotose tardive ou nécrose IP Apotose AnV TNF TNF+CHX

La cytométrie en flux Le tri par CMF Cellules en suspension dans un jet de liquide Formation de goutellettes Charge Electrostatique Déviation des gouttelettes

La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes Technologie dérivée des imprimante à jet d ’encre Jet de liquide instable dans l ’air  gouttelettes Oscillations modifient le point de rupture

La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes 30kHz d=Cte

La cytométrie en flux Le tri par CMF : La Charge des gouttelettes t (µs) ? - + ?

La cytométrie en flux Le tri par CMF : La déviation des gouttelettes - + + - + + - 3000 V + - - +

Cellules Liquide de veine +/- Electronique Détecteur +3000 V -3000 V

La cytométrie en flux Le tri par CMF Technique longue Sélection sur plusieurs paramètres à la fois Choix entre pureté et rendement Bonne pureté >95% Clonages Préparations pour : Mise en culture Biologie moléculaire Western blots Activité enzymatiques Etc …

La cytométrie en flux Le tri par CMF: Tri des cellules NK 64% CD56+ Enricht rosette 1,3% CD56+ CD56 SSc 99% CD56+ Tri CMF

La cytométrie en flux Le tri par CMF: Inhibiteurs des caspases Jurkat 7C11 3 h neg low high