Evaluation comparative de la MRD de LAL en Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand, CHU, Nantes) et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris) CMF: 151 patients (345 prélèvements) PCR: 120 patients (202 prélèvements) Nantes: 128 patients (300 prélèvements) Patients consécutifs, non sélectionnés Extérieurs: 23 patients (45 prélèvements) (7 centres) Patients testés en CMF car PCR problématique N.Nés: 14 cas, Enfants: 127 cas, Adultes: 10 cas 1 aout 2007

marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL B (Nantes; dg: 2000-2007)(n= 225) nombre de LAP pour MRD (n= 112) hyper CD10++ instable 53% hypo CD20- (10+) médiocre 42% CD22++ 30% CD34++homogène 50% CD24+diminué bon 31% (84) CD38+diminué 54% CD45+diminué 37% CD58++ 73% CD123++ 60% (66) asynchro. CD21+ CD10+ 14% (85) CD20+/79b+ CD34+ 13% illégitime My (13,15,33,117) 29% T (2/4/5/7) 3% n LAP CD10+ n=96 CD10 - n=16 2 94% 100% 1 aout 2007

#1 Hématones #2 LAL-B-CD10+ #3 LAL-B-CD10+ Gate: CD19+ 99% 95% CD38-PE 99% 5% 99% 99% CD58-PE 99% 0% CD123-PE 90% 95% 99% CD10-FITC 1 aout 2007

marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL T (Nantes+ext.; dg: 2003-2007)(n= 43) hypo CD2- CD4- CD8- moyen (<0,1%) 33% hyper CD4+ CD8+ moyen (<0,2%) 21% immaturité CD3- cCD3+ CD5+ 63% CD45+dim bon (<0,01%) 60% CD99+ 77% CD34++ bon (<0,05%) 30% TdT+ 70% CD1a+ 42% illégitime CD10 My (13,15,33,117) n LAP LAL-T (n=43) 2 96% 1 aout 2007

Ly (CD45++) Blastes T (CD45+interm.) 92% CD99-PE 72% cCD3-APC 79% cCD3-APC 98% CLO Fab LALTIII CD3- TdT-FITC 1 aout 2007

Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-B de l ’enfant 3(4) Ac.Mo. Constants, conjugués APC, PerCP & FITC CD19APC – CD45perCP – CD10FITC* (* si LAL-B CD10-: ajout du CD20FITC) 4e Ac.Mo. Variable, conjugué PE contrôlePE CD20PE / CD34PE / CD38PE / CD58PE / CD123PE CD11a / CD21PE / CD22PE / CD24PE / CD79bPE CD2PE / CD4PE / CD5PE CD13PE / CD33PE / CD36PE / CD117PE Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 96% des prélèvements 1 aout 2007

Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-T de l ’enfant LAL-T CD3- cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-contrôlefitc cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-TdTfitc cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-contrôlepe cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD99pe cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD34pe cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD1ape cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD10pe cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD13/33/117pe LAL-T CD3+ Combinaisons « à la carte ». Incluant, par exemple: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, TdT, CD56, CD99, Tgd… Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 76 / 85 (90%) des prélèvements 1 aout 2007

Méthode* Marquage à 4 couleurs (PerCP, APC, PE, FITC) (FACScalibur, BD, USA) En acquisition sélective (« live-gating »): - des cellules CD19+ totales si LALB - des cellules cCD3+ totales si LALT CD3- ou CD3+ totales si LALT CD3+ Puis quantification par fenêtrages successifs des cellules leucémiques *Selon Campana D, Constan-Smith E, Cytometry 38:139, 1999 1 aout 2007

1e étape: exemple d’une LAL-B CD10+ Réglages et compensations Traçage de la fenêtre de sélection (live gate) CD19+ Calcul du % de cellules B (hors débris) 95% 2,3% 10.000 évènements cell. B totales (R1xR2): 2,2% cell. Nuclées totales 1 aout 2007

2e étape: exemple d’une LAL-B CD10+ avec MRD négative sélection des cell. B totales du tube (live gate CD19+) puis repérage et comptage des blastes leucémiques par multi-fenêtrage 22.000 évènements sélectionnés (/ 106 cell.) Hématogones CD10+CD38++CD45+/++ 2,1% cellules totales Blastes leucémiques CD10+CD38+CD45- <0,01% cellules totales Blastes leucémiques (MRD)= %Btot.x (R2xR3xR4xR6)= 2,2% x 0,00% (<20 events)= 0% => MRD-LAL=  <0,01% (seuil de sensibilité maxi.) R6 1 aout 2007

LAL-B CD10+ testée avec 6 combinaisons (+ 1 contrôle) Blastes leuc. : 76,3% des cell.B tot (Phénotype: CD10++ CD13+ CD20- CD22+ CD34++ CD38+ CD45-/+ CD58+) MRD: 0,58% cellules totales 10++fort 10++fort 10++fort MRD MRD 34++ homogène 38+faible MRD 10++fort 10++fort MRD MRD MRD 10+ MRD 45+faible

MRD LAL - Faisabilité Technique Origine des patients Éval./total CMF Nantes* 123 / 128 96% Autres** 22 / 23 total 145 / 151 PCR 101 / 116 87% IGH/TCR - ** * Patients consécutifs, non sélectionnés ** Patients testés en CMF pour MRD problématique en PCR 1 aout 2007

selon le type immunologique* MRD LAL - Faisabilité selon le type immunologique* Type Immunologique Éval./total Faisabilité CMF B - CD10+ 84 / 87 97% B – CD10- (MLL+: 12 / 13) 13 / 13 100% T – imm. (TI, TII) 8 / 8 T – mat. (TIII, TIV) 19 / 21 90% PCR 78 / 82 95% IGH/TCR B – CD10- (MLL: 10 / 11) 5 / 11 45%* TCR 4 / 7 57% 18 / 20 Patients de Nantes (consécutifs, non sélectionnés), uniquement *p<0.001 1 aout 2007

MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements MRD LAL - Faisabilité Cause des échecs de la détermination de la MRD en CMF (9 prélèv.(3%); 6 patients (4%)) # EGIL cause Pt de MRD inéval. N1 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis. (2LAP:22++,34++) Excès d’hématogones (7%) 1 / 2 (J70) (J35: OK) N2 Sensib. Insuffis.(1LAP: CD20-) Excès d’hématogones (4-13%) 3 / 4 (J70,227,372) N3 B2 / CD10+ Absence de LAP 1 / 1 (J35) N4 T4 / CD3+Tgd+ Sensib. Insuffis.(CD2- Tgd+) Excès de Tgd+ normaux 1 / 3 (J117 post-allo.) (J34,J57: OK=MRD++) N5 Sensib. Insuffis.(Tgd+) Résultats trop incertains 2 / 3 (J59,101) (J31: OK=MRD++) E5 T3 CD3- /CD3+Tab+ 2 clones de phénotype impossible à distinguer 1 / 1 (J182) MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements 1 aout 2007

MRD LAL - Faisabilité de la CMF en cas de PCR IGH/TCR problématique Type Immuno. B-CD10+ B–CD10- T–immature / TCR-* T–mature / TCR+* Total CMF évaluable Total PCR problèm. n. (%) Cas n. prélèv 9 (26%) 20 28 29 7 (22%) 14 34 91 32 88 97% *surface T-cell receptor (CD3/Tab/Tgd) 1 aout 2007

MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le type immunologique - nombre de prélèvements= 328/337 (97%)* - Type n MRD négative MRD positive Immuno. <0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1% B-CD10+ 181 125 69% 19 10% 13 14 21% 10 B–CD10- 40 35% 4 6 9 55% 7 T 107 66 15 19%** 24% Total 328 205 62% 38 12% 28 9% 33 24 7% *prélèvements inévaluables en CMF exclus – n= 9 (3%) **comparaison MRD <0,1% LALT v LALB (tout type) p=0,03 (X2 test) 1 aout 2007

MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le point de suivi (nombre de prélèvements= 342*) Pt de suivi n MRD négative MRD positive <0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1% MRD-J21** (Per-induc.) MRD-J35 (post-induc.) 15 120 8 53% 75 63% 0% 7 6% 9 3 47% 13 31% 4 16 MRD-J90 (conso.1) 97 60 62% 18 18%*** 5 20% MRD3** (tardif) 76 50 66% 10% 11 24% 2 MRD4** (post-allo.) 34 21 12% 26% 1 *prélèvements inévaluables en CMF exclus, **biaisés (fait en cas de pb clinique ou de cyto) ***comparaison MRD1 v MRD2: p=0.01 (X2 test) 1 aout 2007

MRD LAL - Fiabilité de la CMF Comparaison des résultats de MRD des prélèvements étudiés en PCR IGH/TCR et en CMF parallèlement (tandem study) (nombre de prélèvements évaluables= 165) Concordance CMF=PCR 155 94% Discordance CMF<PCR 7 4% B-CD10+ (3 LAP) B-CD10+ (2 LAP) B-CD10+ (1 LAP) T1 (4 LAP) T3ab (2LAP) MRD1: CMF+:0,7% /PCR+>1% MRD4: CMF+:0,07% /PCR+ 0,1-0,5% MRD4: CMF+:0,01% /PCR+ 0,1% MRD1: CMF+:0,25% /PCR+>1% MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,5-1% MRD1: CMF+:0,32% /PCR+>1% MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,1-0,5% CMF>PCR 3 2% T3ab (3LAP)(Rech.) B-CD10+ (3LAP) MRD1: CMF+:0,20% /PCR+<0.1% MRD2: CMF+:0,32% /PCR+<0,1% MRD1: CMF+:0,34% /PCR+<0.1% 1 aout 2007

Conclusions Excellente concordance des résultats de MRD en CMF-4 couleurs et PCR IGH-TCR compétitive (94%) En cas de discordance, le niveau de MRD en CMF est généralement plus faible qu’en PCR Applicabilité de la CMF supérieure à celle de la PCR (95% versus 87%), particulièrement pour les LAL-B CD10- et les LAL-T immatures CMF-4 couleurs plus rapide, plus simple (et moins coûteuse?) que la PCR quantitative mais fiabilité des résultats dépendant du nombre et, surtout de la qualité (sensibilité et stabilité) des marq. leucémiques testés, tant en CMF, qu’en PCR limites de la CMF: Qualité des prélèv. (viabilité cellulaire++) & Reproductibilité inter-labo. de la CMF?