Denis NOUBOUOSSIE, Anne DEMULDER CHU Brugmann, Bruxelles Journée de la drépanocytose, Hôpital Erasme, Février 2009 HYPERCOAGULABILITE DANS LA DREPANOCYTOSE: UN NOUVEL OUTIL DIAGNOSTIQUE? Denis NOUBOUOSSIE, Anne DEMULDER CHU Brugmann, Bruxelles

PLAN Hypercoagulabilité dans les syndromes drépanocytaires (SD) Définition et arguments Mécanismes pathogéniques Faiblesse des méthodes diagnostiques actuelles Test de Génération de Thrombine in vitro (TGT) Principe et technique (CAT) Avantages et limites Etude préliminaire de la GT chez les enfants SD

Etat d’hypercoagulabilité Définition Situation clinique associée à une tendance anormale à développer une thrombose (caillot de fibrine) dans la circulation veineuse et/ou artérielle. Causes constitutionnelles ou acquises Triade de Virchow: la thrombose résulte d’une anomalie du vaisseau, du flux ou d’un constituant du sang NB Possible thrombose sans facteur de risque identifié Possible facteur de risque identifié sans thrombose

Hypercoagulabilité dans les SD Arguments cliniques et radiologiques Etude CSSCD USA 1978-1988 (n=4082, durée moyenne de suivi: 5,2 ± 2 ans) (Semin Cerebrovasc Dis Stroke 2002;2:143-50) Incidence AVC: 0,46% patients/an Anomalies cérébrales IRM: 22% (patients >6 ans) Infarcissements cérébraux infracliniques: 13% Registre national Belgique (Le et al, présentation orale, Oct 2009) AVC/AIT: 3% Anomalies cérébrales à l’IRM: 18% STA: 19% Etude Turkie: IRM chez 50 patients avec symptomes du SNC (Alkan et al. 2009; Eur J Radiol: in press) Infarcissements cérébraux: 32% Thrombose sinus veineux: 2%

Hypercoagulabilité dans les SD Arguments anatomopathologiques Thrombi in situ retrouvés à l’autopsie: Dans les artères cérébrales des patients décédés d’AVC (Rothman et al, Ann neurol 1986) Dans les artères pulmonaires des patients décédés de STA (Adedeji et al, Arch Pathol Lab Med 2001)

Hypercoagulabilité dans les SD Arguments biologiques (Ataga and Key, Hematology 2007) Hyperactivation des plaquettes Agrégométrie, cytométrie en flux ↑ des paramètres d’activation de thrombine in vivo Fragments de thrombine, complexes T-AT ↑ des paramètres de fibrinolyse in vivo D-dimers, complexes P-AP ↓ des anticogulants physiologiques Système protéine C/protéine S Présence des anticorps anti-phospholipides Pas de facteur de risque thrombotique constitutionnel associé aux SD

Hypercoagulabilité dans les SD Pathogénèse From Ataga. Haematologica 2009;14(11):1481-4

Phosphatidylserine exposition From Piccin et al. Blood Rev 2007;21: 157-171

Microparticules

Microparticules et hémostase Certaines MP sont dites procoagulantes car véhiculent le FT et les PPL (PS) MP procoagulantes en nombre augmenté chez les patients à risque de thrombose: Dans les maladies cardiovasculaires Dans les cancers Dans les SD MP FT+ dérivant des monocytes et des cellules endothéliales (Shet et al, Blood 2003) MP PS+ dérivant des GR et des plaquettes (Westermann et al, Br J Haematol 2008)

Points faibles de l’étude de l’hémostase dans les SD Etude segmentaire et non intégrée de l’hémostase Paramètres étudiés: Ne miment pas la physiologie de l’hémostase Peuvent être influencés par leur élimination Bonne VPN mais mauvaise VPP Participations non prises en compte Cellules du sang Vaisseau sanguin Flux sanguin

Test de génération de trombine in vitro (TGT) Connu depuis les années 1950, mais difficile à réaliser Abandonné au profit des tests en un seul temps (aPTT, PTT, dosage des facteurs) Travaux de Hemker et al, Améliorations techniques Mise au point d’un software Interprétation par des paramètres précis Calibrated Automated Thrombinography (CAT)

Calibrated Automated Thrombinography (CAT) Principe Activation par un mélange de facteur tissulaire (FT) + phospholipides (PL) Cascade de réactions aboutissant à la génération de thrombine Activité de la thrombine générée sur un substrat fluorescent Mesure continue de la fluorescence Conversion automatique de la fluorescence en concentration de thrombine active grâce à un calibrant analysé en parallèle

Courbe de génération de thrombine D’après Josso, Hemker et Mann, modifié par F. Debaugnies

Calibrated Automated Thrombinography (CAT) Avantages Il mesure directement l’activité de l’enzyme clé de la coagulation Intègre l’activité des facteurs procoagulants et anticoagulants Mime mieux la physiologie de la génération de thrombine in vivo Technique automatisée avec une bonne reproductibilité Limites Défaut de standardisation Importante variabilité inter-individus Pas de participation des cellules sanguines, du vaisseau et du flux sanguin

CAT et hypercoagulabilité chez les enfants drépanocytaires: étude préliminaire But: caractériser les différentes phases de la génération de thrombine chez les enfants drépanocytaires cliniquement stables

Méthodologie (1) Patients Groupe témoins n = 19 HbSS stables suivis à l’HUDERF Age: 4 – 20 ans, médiane = 8 Sexe: M = 10; F = 9 Groupe témoins n = 8 pré-op petite chirurgie Age: 4 – 20 ans, médiane = 8,5 Sexe: M = 4; F = 4

Méthodologie (2) Prélèvement: Sang veineux,tube citraté à 0,109M Double centrifugation: Obtention d’un PPP Conservation à -80°C TGT par technique CAT Activation par 1pM FT + 4µM PL ± Thrombomoduline (TM) Six paramètres analysés: Lagtime(min), Peak(nM), Ttpeak(min), Vel ind(nM/min), ETP(nM), Starttail(min) Comparaison des 2 groupes: test de Mann Withney; p<0,05 = significatif

Résultats Without thrombomodulin With addition of thrombomodulin % of reduction after addition of thrombomodulin Controls (n=8) SCD (n=19) Lagtime (min) 5,1(3,9-8,3) 5(2,5-8,8) 5,2(4,07-8,3) 5,1(2,5-10,1) NE Peak (nM) 96,7 (48,8-199,8) 141,1 (57,1-230,6) 88,6 (49,2-177) 145,2* (56,0-225,8) TtPeak 10,1 (8,4-14) 8,7* (5,2-13,9) 10,8 (9,2-14,9) 9,3 (4,8-16,4) Velocity Index (nM/min) 22,5 (8,1-46,1) 36,3* (10,7-99,9) 26,1 (11,4-52,2) 40,8 (14,9-117,5) ETP 855,5 (604,5-1584) 861 (564-1485) 562 (422-1164) 706 (381-1184) 36,5 (22-44) 14* (-4-50) Startail 30,7 (23,9-44,4) 24,9 (15,7-38,0) 24,5 (19,3-28,5) 21,0 (15,4-28,5) 20 (14-36) 12* (1-31)

p Sans TM Avec TM Lag time 1,000 0,936 TtPeak 0,027 0,056 Velocity Index 0,059 Peak 0,098 0,046 ETP 0,978 0,253 Start tail 0,075 0,094

Augmentation des vélocités chez les SD Discussion Chaari et al, abstract ASH 2009 ↑ vitesse GT liée à la présence des MP de GR Shah et al, abstract ASH 2009 Pas de différence entre plasma riche et dépourvu de MP Rôle de ↑ FVIII!!

p = 0,038 p = 0,024 Anomalie de la régulation de la génération de thrombine par le système TM/PC/PS!

Réduction ETP et activité PC: Nx vs PC>50 vs PC<50

Conclusion Le TGT permet une meilleure évaluation du phénotype hémostatique des patients SD Il montre Une accélération de la phase de propagation Une augmentation des concentrations de thrombine générée Un défaut de neutralisation par le système TM/PC/PS probablement compensé par les autres anticoagulants physiologiques Cependant, nécessité: Études à plus grande échelle Standardisation de la méthode

Remerciements HUDERF CHU Brugmann Médecins du service d’hémato-oncologie Personnel de S60 Personnel service du prélèvement Personnel des S66 CHU Brugmann Personnel du tri Personnel du laboratoire d’hématologie et de coagulation

Merci pour votre attention!