Méthode d ’étude de la cellule normale et pathologique : Mise en culture des cellules et tissus Master M1: cellule normale à cellule cancéreuse Dr Mossuz P 27/01/06

I : les tissus Origine Contraintes Ensemble de cellules de types et d ’origine embryonnaire différente Associés en général à une matrice extra cellulaire (glycoprotéine, protéoglycane, fibronectine..) Origine prélèvements biopsiques, fragment de tissus Contraintes Les tissus pure sont rares; nombreux tissus accessoires (tissus conjonctifs, vaisseaux sanguins, tissu nerveux..) 2 types de cultures possibles - culture direct du fragment= culture primaire -fragmentation de la pièce biopsique = dissociation des tissus pour récupérer la fraction cellulaire d ’intérêt

Dissociation des tissus 1) mécanique scalpel, broyeur , filtration , sonication 2) chimique solution sans calcium, chelateurs de calcium, de Mg… (cations divalents) 3) enzymatique digestion par la trypsine, la collagénase, hyaluronidase Rmq : * Très grande diversité des tissus = très grande diversité des protocoles le plus souvent mélange de 2 ou 3 étapes * Le mieux est l ’ennemi du bien : les cellules sont fragiles!!

Culture de kératinocytes Prélèvement cutanée Fragmentation au scalpel Application : recherche, thérapeutique Dissociation cellulaire (x4/5) mécanique trypsine EDTA Culture sur sous couche après numération Surnageant + cellules en suspension

II : les cellules 1) Les cellules circulantes / en suspension Origine le sang périphérique, la moelle osseuse , les liquides physiologiques (liquides pleuraux,... ) le sang de cordon Intérêts source relativement pure (peu de types cellulaires mélangés) facilité d ’accès matériel riche mise en culture directe

Purification cellulaire * Cellules en suspensions Sang périphérique : cellules granuleuses, lymphocytes , monocytes Moelle osseuse : progéniteurs érythroïdes, mégacaryocytaire, granuleux Liquide biologique : cellules épithéliale, cellules différenciées , cellules tumorales * Tissus en culture primaire à partir de la suspension cellulaire obtenue par dissociation du tissus formation d ’une couche adhérente contenant les différents type cellulaire présents dans le tissus Pour obtenir une culture pure (un seul type cellulaire) nécessité de séparer les différents types cellulaires

Méthode de purification 1) méthode physique : séparation basée sur les différences de densité des cellules centrifugation différentielle en gradient de densité ultracentrifugation electrophorèse cytométrie de flux 2) avantage prolifératif, métabolique croissance en milieu sans facteur de croissance milieu sans sérum 3) tri par adhérence ex monocyte/macrophage

cytométrie de flux FACS sorter billes immuno- magnétiques 4) Tri immunologique séparation à l ’aide de marqueurs protéiques (antigènes) de surface spécifique d ’un type cellulaire ex : glycoprotéine érythrocytaire marqueurs tumoraux marqueurs de lignée marqueur épithélial : kératine marqueur leucocytaire : CD45 cytométrie de flux FACS sorter billes immuno- magnétiques Tri sur boite « imuno capping »

Tri par cytométrie de flux Principe : Séparation des cellules à l ’aide d’un cytomètre de flux -analyse des cellules en suspension -caractérisation par la taille (FSC) et le contenu (SSC) -analyse de l ’expression d ’antigène de surface

Récupération de la fraction d ’intérêt Séparation des cellules en les isolant dans une goutte, par fractionnement du flux d'eau physiologique qui les contient au travers d'une buse(0.05mm). Analyse des caractéristiques de chaque cellule sur différents critères (taille, diffraction, la densité de granulation évaluée par absorbance, la présence ou non d'antigènes sur la surface cellulaire). Tri des cellules dans des gouttes plus ou moins chargées, selon que la cellule corresponde aux critères fixés par l'opérateur. Leur trajectoire sera plus ou moins déviée en passant entre 2 électrodes qui ménagent un champs électrique. Récupération de la fraction d ’intérêt

Suspension cellulaire électrodes laser Cellules chargées Cellules non chargées

Moelle humaine normale Tri par billes immuno-magnétiques Moelle humaine normale Purification de cellules souches hématopoïétiques CD34+/HLA DR- CD34 = glycoprotéine membranaire spécifique des cellules souches hématopoïétiques, absentes des cellules du sang périphérique HLA DR = antigène d ’histocompatibilité de classe II absent des CSH Principe : tri en 2 étapes, purification des cellules CD34+ puis déplétion des cellules DR+

Ac AntiCD34 1) Fraction CD34+/ DR+ Ac Anti DR 2) Fraction CD34+/DR-

2) Les Lignées cellulaires immortalisées Rmq : les cellules normales en culture primaire ont un potentiel limité de prolifération in vitro, même en présence de facteur de croissance (50 à 60 temps de doublement maxi) mortalité par senéscence, raccourcissement des télomères le potentiel prolifératif est inversement proportionnel au degré de différenciation Une lignée cellulaire immortalisée peut être définie par la capacité de plus de 150-200 tps de doublement, ou la possibilité de cultiver les cellules plus d ’un an, sans interruption

Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par infection virale Principe : expression par transfection cellulaire d ’une protéine virale

* Expression d ’un oncogène Immortalisation de cellules normales (non cancéreuses) par transfection * Expression d ’un oncogène - Expression stable d ’un oncogène virale responsable de la transformation des cellules Ex C-Myc oncogène codant pour un facteur de transcription régulant la prolifération et la mort cellulaire / rôle ++ dans la lymphomagénèse * Sur-expression d ’un récepteur de facteur de croissance Ex : Rcp GM-CSF * Sur-expression d ’une protéine kinase régulant la prolifération cellulaire Ex : p210 protéine dérégulée dans la LMC

Sélection antibiotique Principe : expression d ’un gène de résistance à un ATB (ex néomycine) permettant de sélectionner les cellules transfectées (obtention de lignée clonale stable) B )Avec sélection, population non transfectée A) Sans sélection C-D) Avec sélection, population transfectée

A partir de cellules tumorales Ex : lignées cellulaires dérivées de patients présentant une hémopathie/tumeurs solides... Lignée Hela : carcinome cervical Raji = lymphome de Burkitt HL60 = LAM3 Lignée établie spontanément en culture par sélection de clone prolifératif Possibilité de sélection par passage sur la souris

Un cas particulier : les cellules souches *Les cellules souches embryonnaires de souris obtenue à partie de blastocytes de souris établissement de lignées cultivées en présence de facteur de croissance (LIF) différenciation orientée par des facteurs de croissance intérêt : étude des mécanismes moléculaires de la différenciation cellulaire (oncogénèse et ontogénèse) souris KO *Les cellules souches humaines -les cellules souches dérivés d ’embryon au stade très précoce (ES) *les cellules germinatives dérivées de fœtus avortés cellules de la lignée germinales (ovule et spermatozoide) = embryonnic germ cells (EG) *Les cellules souches adultes

III Méthodes de culture 1) Les milieux de culture Doivent répondre aux exigences minimum des cellules animales H2o ions minéraux( nacl, Kcl, mgcl2….) osmolarité = 9g/1000 source de carbone et d ’énergie (glucose) source d ’azote (acides aminées) facteurs de croissance : acides aminées éssentiels, vitamines, acide gras, cytokines Gaz O2 et CO2 système tampon , Ph stable 7.4 (indicateur de pH) RPMi, HBS DMEM, MEM…….+ sérum (SVF) + ATB

2) Paramètres régulant la prolifération cellulaire La température (37°c) l ’hygrométrie (contrôle de l ’évaporation) 90% d ’humidité le pH CO2… la densité cellulaire le pourcentage de sérum la dépendance en facteur de croissance (ex lignée IL3 dépendante) 1 contrainte majeure : la stérilité microbienne protection des cellules et des manipulateurs

Cinétique de la croissance cellulaire 1er phase = phase de latence pas de division cellulaire dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire 2eme phase = phase exponentielle Phase de division cellulaire temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h) 3eme phase = phase stationnaire épuisement du milieu = arrêt de la prolifération 4ém phase = poursuite de la croissance cellulaire (repiquage) ou mort cellulaire

Cinétique de la croissance cellulaire Phase exponentielle Phase stationnaire Phase de latence (cellules quiescentes) Nombre de cellules 10.6/ml Mort cellulaire Temps de doublement Temps (jours)

Croissance cellulaire Pendant la phase exponentielle les cellules sont distribuées de façon hétérogène dans les différentes parties du cycle cellulaire. La culture cellulaire est donc un ensemble hétérogène de cellules caractérisées par des propriétés métaboliques différentes Il est possible de synchroniser les cellules privation en facteur de croissance = mise en G0 séparation cellulaire par gradient de Ficoll ultra centrifugation méthode chimique drogue bloquant la phase S (hydrea) déplétion calcique

les cellules adhérentes : la confluence Confluence = occupation de toute la surface de la boite de culture par les cellules s ’accompagne en général d ’un arrêt de la prolifération par inhibition de contact Cas particulier des cellules transformées (virus, oncogènes..) perte de l ’inhibition de contact culture non régulée témoin de transformation

III Différents types de culture * en suspension (cellules non adhérentes) * en couche mono cellulaire (cellules adhérentes) * sur sous couche nutritive (feeder) culture sur un support cellulaire (fibroblaste ++, cellule endothéliale , adipocytes ) Ex lignée stromale murine produisant de l ’IL3 * cultures en milieu semi solide / cultures clonogéniques utilisation de collagène, méthyl cellulose, agar dans lesquels sont implantées les cellules permet la formation de colonies clonale (dérivée d ’une seule cellule)

Cultures clonogéniques de progéniteurs hématopoïétiques Systèmes de culture permettant d’identifier et de quantifier les progéniteurs hématopoïétiques différenciés (différenciation myéloïdes) Principe : Identification rétrospective des progéniteurs différenciés par leur capacité à produire des colonies (CFU) dans un milieu de culture semi-solide. Les colonies résultent de la prolifération clonale d’un progéniteur en présence de facteurs de croissances hématopoïétiques

Lignée érythroïdes BFU-E

Lignée granulo-macrophagique CFU-GM

Lignée mégacaryocytaire CFU-MK APAAP-CD41 Microscope-inversé MGG

Clonage cellulaire intérêt du clonage Une suspension cellulaire (même purifiée) est le plus souvent oligoclonale plusieurs types cellulaires possibles hétérogénéité d ’une population tumorale intérêt du clonage Principe : isoler par dilution limite des populations monoclonale les cellules sont cultivées dans des petits volume en dilution au 1/10, 1/100, 1/1000; jusqu ’à obtenir une implantation théorique de une cellule par puit qui donnera une population monoclonale vraie ( cellules totalement identique, phénotypiquement, cytogénétiquement, morphologiquement..)

Population oligoclonale A+ B Clone A - Clone A Clone B -