CREATION D’ANIMAUX TRANSGENIQUES PAR MODIFICATION DES SPERMATOZOIDES Yves Demulière Lise Grout Ludovic Simon

Création d’animaux transgéniques par modification des spermatozoïdes I.Transgenèse par modification des spermatozoïdes : 1.Avantages par rapport aux autres méthodes 2.Incubation avec de l’ADN 3.Electroporation 4.Décondensation du noyau II.Transgenèse par modification des précurseurs : 1.Transfection et recombinaison homologue 2.Infection virale III.Application au génie génétique : 1.Espoirs 2.Problèmes éthiques

I.Transgenèse par modification des spermatozoïdes 1. Avantages par rapport aux autres méthodes:

a. Présentation des autres méthodes Microinjection d’ADN : Microinjection d’ADN : - introduction d'un gène ou plus d'un autre animal, d'espèce identique ou différente, dans le pronucléus d'un ovocyte fécondé - introduction d'un gène ou plus d'un autre animal, d'espèce identique ou différente, dans le pronucléus d'un ovocyte fécondé - forte probabilité de ne pas s'intégrer dans un site de l'ADN hôte favorisant son expression - forte probabilité de ne pas s'intégrer dans un site de l'ADN hôte favorisant son expression Transfert de gènes à l'aide de cellules souches embryonnaires : Transfert de gènes à l'aide de cellules souches embryonnaires : - recombinaison homologue dans une culture in vitro de cellules ES, intégrées à un embryon au stade blastocyte - recombinaison homologue dans une culture in vitro de cellules ES, intégrées à un embryon au stade blastocyte - animal chimérique - animal chimérique - méthode knock-out - méthode knock-out Transfert de gènes à l'aide de rétrovirus : Transfert de gènes à l'aide de rétrovirus : - vecteurs (en général un plasmide ou un virus), les rétrovirus présentant une facilité à infecter les cellules hôtes - vecteurs (en général un plasmide ou un virus), les rétrovirus présentant une facilité à infecter les cellules hôtes - chimères, l’ADN modifié devant être intégré aux cellules germinales pour que le transgène puisse être transmis - chimères, l’ADN modifié devant être intégré aux cellules germinales pour que le transgène puisse être transmis

b. Problèmes avec ces méthodes

Problème d’individus chimères Problème d’individus chimères Aucun individu mosaïque Aucun individu mosaïque  seul 1à 20% des individus obtenus en F1 transgéniques  Nécessite donc des centaines de poissons et deux générations pour avoir une lignée transgénique  Taux d’individu transgénique plus faible en F1  Pas de F2 nécessaire et screening réalisé a moins grande échelle

2. Incubation avec de l’ADN Souris Souris Association facile et stable Association facile et stable ADN/membrane externe Etendue à d’autres espèces => ECHEC Etendue à d’autres espèces => ECHEC A grande échelle -> faible taux A grande échelle -> faible taux Gène non intègre, réarrangé et non fonctionnel Gène non intègre, réarrangé et non fonctionnel (mouton : spz lavés) (mouton : spz lavés)

3. Electroporation Poisson zèbre Poisson zèbre Choc électrique perméabilisant la membrane Choc électrique perméabilisant la membrane Fonctionnel mais pas transmis aux générations suivantes (pas intégré ?) Fonctionnel mais pas transmis aux générations suivantes (pas intégré ?) Etendu à d’autres poissons -> pas de lignées transgéniques stables Etendu à d’autres poissons -> pas de lignées transgéniques stables  Spz matures ne sont pas de bons véhicules

4. Décondensation du noyau : Xénope Xénope Isolation, décondensation, enzymes de restriction, ADN linéarisé Isolation, décondensation, enzymes de restriction, ADN linéarisé Injection dans cytoplasme d’un ovocyte Injection dans cytoplasme d’un ovocyte  Nb élevé de xénopes transgéniques  Multiples copies de séquences  Pas de mosaïques  Fonctionnalité et transmission à la descendance

II. Transgenèse par modification des précurseurs : Culture et maturation des spz difficiles 1. Transfection et recombinaison homologue: Spermatogonies qqs heures en culture Spermatogonies qqs heures en culture Réimplantation dans testicule d’une autre souris Réimplantation dans testicule d’une autre souris Marquage par LacZ Marquage par LacZ  ADN intégré, fonctionnel, transmis ?

2. Infection virale : a. In vivo Injection de lentivirus dans les tubes séminifères Injection de lentivirus dans les tubes séminifères  Obtention de cellules de Sertoli infecté mais pas de souris transgéniques obtenues après fécondation Injection intracytoplasmique de spermatozoïde préalablement sélectionné par fluorescence Injection intracytoplasmique de spermatozoïde préalablement sélectionné par fluorescence  Seul succès obtenu jusqu’à présent avec des méthodes non virales

b. In vitro : Poisson zèbre Méthode :  Transfection avec plasmide codant une protéine d’enveloppe  Dissociation des testicules  Centrifugation -> récupération de précurseurs  Mise en culture sur cellules nourricières Résultat :  Intégration des gènes avant différentiation (LacZ)  Bon résultats ≈ 5,6% de PS transgéniques hétérozygotes  Facteurs influençant les taux d’intégration ?  Sensibilité Cellules germinales/cell. Somatiques

III. Application au génie génétique : 1. Espoirs : A propos des souris de labo? A propos des souris de labo? Production d’organe humanisé ex porc Production d’organe humanisé ex porc Aspect économique Aspect économique  Ex des saumons ayant reçu le gène d’une hormone de croissance sont vendables deux fois plus tôt en mangeant moins  Production de protéine d’intérêt pharmaceutique par certains mammifères Résistance à certaines bactéries Résistance à certaines bactéries  Succès chez la souris ( en cours de réalisation pour la vache)

2. Les problèmes associés Production d’individus-médicament Production d’individus-médicament Production d’animaux super-résistants Production d’animaux super-résistants  Problèmes écologiques associés  Problème des résistances bactériennes Problème de l’innocuité pour l’Homme Problème de l’innocuité pour l’Homme Problème de la conquête de la confiance du consommateur Problème de la conquête de la confiance du consommateur

Bibliographie J-M Houdebine Les animaux trangéniques J-M Houdebine Les animaux trangéniques PNAS, 3 février 2004, Kurita et al Transgenis Zebrafish produced by retroviral infection of in vitro-cultured sperm PNAS, 3 février 2004, Kurita et al Transgenis Zebrafish produced by retroviral infection of in vitro-cultured sperm Vincent Thizeau, Transgenèse animale, les transfert de gènes chez les animaux Vincent Thizeau, Transgenèse animale, les transfert de gènes chez les animaux