Amélioration de la sensibilité du kit ELISA DIASOURCE réf.: KAP0621 Poster 7 Amélioration de la sensibilité du kit ELISA DIASOURCE réf.: KAP0621 pour le dosage de l’oestradiol-17β dans le plasma ovin Lionel Lardic1, Rex J. Scaramuzzi1, Joelle Dupont1, Justine Gauthier1, Claude Fabre-Nys1 1 – INRA, UMR85 Physiologie de la Reproduction et des Comportements, CNRS, Université de Tours, IFCE, 37380 Nouzilly, France

Poster 7 Introduction : Les kits de dosages de l’œstradiol-17β (E2) commercialisés sont calibrés pour déterminer, dans le plasma humain, des concentrations entre 5 et 1000 pg/mL. Cependant, dans l’espèce ovine, les concentrations plasmatiques d’E2 varient entre 0,1 et 10 pg/mL selon le stade physiologique. Le kit de dosage RIA DIASORIN (réf. : P2210) après adaptation par nos soins, possédait la sensibilité nécessaire aux études chez les ovins. Depuis l’arrêt de sa commercialisation en 2009, nous avons été orientés vers les kits DIASOURCE. Mais ils présentent une sensibilité trop faible. Les objectifs de notre étude ont été de tester le kit ELISA E2 DIASOURCE (réf. : KAP0621) dans plusieurs conditions pour améliorer sa sensibilité.

Poster 7 Méthode (1): Nous avons comparé les valeurs obtenues pour des gammes d’E2 allant de 0,39 à 1600 pg/mL avec: le kit RIA DIASORIN par déplacement 24h +24h à 4°C (données moyennes d’avant 2009) le kit RIA DIASOURCE testé précédemment (Lardic et al 2010) et le kit ELISA DIASOURCE, utilisé dans 4 conditions différentes: Condition 1: gamme tampon 50µL,compétition 2h température ambiante (TA). Condition 2: gamme tampon 100µL, compétition 2h à TA. Condition 3: gamme tampon 100µL et déplacement : échantillon + 100, 75 et 50% de la quantité d’anticorps préconisée 24h à TA puis traceur 24h à 4°C. Condition 4: gamme en plasma ovin extraite sur 200, 300 et 500µL et reprise avec 150µL d’un tampon Tris EDTA et déplacement dans les mêmes conditions que la condition 3 avec 50% de la quantité d’anticorps. L. Lardic, C. Rico et D. Monniaux : Test de sensibilité d’un kit DIASOURCE de dosage de l’oestradiol-17β: 27e colloque CORATA-IBS, Marseille 2010

Poster 7 Méthode (2): Des surcharges de 0,25 à 5 pg/mL sont dosées en condition 4. Afin de tester l’exactitude de la méthode. Puis, 30 échantillons ovins, dosés avec le kit RIA DIASORIN en 2003, ont été dosés à nouveau avec le kit ELISA DIASOURCE en condition 4 avec extraction sur 300µL afin d’évaluer la corrélation entre les deux méthodes. Une fois les performances du dosage jugées satisfaisantes nous avons utilisé cette technique pour comparer les concentrations plasmatiques en oestradiol de 3 groupes de brebis en anoestrus présentant des réponses différentes à l’introduction du mâle. Groupe 1: pic pré ovulatoire de LH 16 à 20 heures après le mâle (n=10) Groupe 2: pic pré ovulatoire de LH moins de 8 heures après le mâle (n=13) Groupe 3: pas de réponse ou pic tardif (>56h, n=5)

Résultats (1): comparaisons de gammes Poster 7 Résultats (1): comparaisons de gammes Le kit ELISA DIASOURCE en condition 1 n’est pas plus sensible que le RIA DIASOURCE. En condition 2, il devient 2 fois plus sensible. En conditions 3, il est 5 fois plus sensible avec 50% du volume initial d’anticorps. En conditions 4, il est entre 10 et 16 fois plus sensible. Il devient aussi sensible que le dosage DIASORIN. Sens de l’amélioration de la sensibilité

300µL est le volume ou la corrélation est la meilleure. Poster 7 Résultats  (2): quelques tests Une bonne corrélation est observée entre les concentrations attendues et observées pour les surcharges plasmatiques allant de 0,25 à 5pg/ml extraites en 200, 300 et 500µl. 300µL est le volume ou la corrélation est la meilleure. Une excellente corrélation est observée (r = 0.955, p <0.0001) pour 30 échantillons dosés en RIA DIASORIN en 2003 et ELISA DIASOURCE 2012 condition 4

Heures par rapport à l’introduction de mâle Poster 7 Résultats (3): de la méthode à la science… …effet mâle et rôle de l’oestradiol-17β Exemple de profil LH pour un animal de chaque groupe 2 4 8 24 40 56 Temps (heures) 20 LH (ng/ml) Groupe 1 N=10 Groupe 2 N=13 Groupe 3 N=5 Heures par rapport à l’introduction de mâle 1 2 3 4 5 6 7 8 -24 -22 -20 -1,5 E2 pg/ml ** NS La réponse LH précoce n’est pas due à la présence de concentrations élevées d’oestradiol avant l’introduction du mâle = Introduction du mâle (bélier) Courbes moyennes en E2 pour chaque groupe

Poster 7 Conclusion : Grace à l’extraction sur 300µL des échantillons et des gammes en plasma ovin, une reprise dans 150µL en tampon tris EDTA et un dosage avec le kit ELISA DIASOURCE en déplacement avec 50% du volume initial d’anticorps, nous avons pu améliorer la sensibilité du dosage et le rendre aussi sensible que le RIA DIASORIN. Il nous permet donc de déterminer les concentrations plasmatiques physiologiques d’E2 chez les ovins. La sensibilité du dosage calculée pour Bo-2SD est de 0,78 pg/mL. Mais au vu des résultats obtenus nous arrivons avec fiabilité à déterminer des concentrations à partir de 0,5 pg/mL.

Poster 7 Résultats: Le kit RIA DIASOURCE n’est pas aussi sensible que le kit RIA DIASORIN. Le kit ELISA DIASOURCE en condition 1 n’est pas plus sensible que le RIA DIASOURCE. En condition 2, il devient presque 2 fois plus sensible. En condition 3, il est 5 fois plus sensible et plus particulièrement avec 50% du volume initial d’anticorps. En condition 4, il est entre 10 et 16 fois plus sensible. Il devient plus sensible que le dosage DIASORIN. (Tableau 1) Tableau 1: concentrations en pg/mL des gammes E2 pour différentes valeurs du pourcentage de liaison (B/Bo)

Mechanisms: role of oestradiol Variability Mechanisms: role of oestradiol 2 4 LH (ng/ml) 20 40 8 24 56 2 4 LH (ng/ml) 8 24 40 56 Surge 16 to 20h n=10 No surge or late surge n= 5 Early surge n=13 2 4 LH (ng/ml) 20 40 8 24 56 E2 pg/mL 8 ** 7 6 5 4 The early surge is not due to the presence of elevated oestradiol concentration NS 3 2 1 -24 -22 -20 -1,5 2 4 8 Heures par rapport à l’introduction de mâle